黑色素細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建組織工程皮膚的初步研究.pdf

1、皮膚缺損創(chuàng)面修復(fù)是整形外科臨床常見問題之一。目前廣泛采用自/異體皮膚移植修復(fù)皮膚創(chuàng)面缺損，但是這種方法存在著皮膚來源受限、對(duì)機(jī)體產(chǎn)生二次創(chuàng)傷等缺陷。組織工程皮膚的研發(fā)和應(yīng)用為皮膚缺損修復(fù)提供了新的治療策略。目前已有組織工程化的真皮和全層皮膚等產(chǎn)品上市，然而這些“人工皮膚”目前僅發(fā)揮遮蓋創(chuàng)面和加速愈合的功能，尚不是真正意義上的具有色澤、排汗、生發(fā)等生物學(xué)功能的正常“皮膚”組織，因而構(gòu)建具有正常生物學(xué)功能的組織工程皮膚是該領(lǐng)域今后需重點(diǎn)關(guān)注

2、的研究課題。皮膚中的黑色素細(xì)胞對(duì)于皮膚色澤的調(diào)節(jié)以及防止紫外線照射引起的細(xì)胞損傷起著重要的作用。本研究在前期以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程全層皮膚的研究基礎(chǔ)上，將黑色素細(xì)胞與BMSCs以適合的比例混合培養(yǎng)，并利用I型膠原膜為支架材料構(gòu)建含有色素細(xì)胞的組織工程皮膚，為研發(fā)具有色素功能的組織工程皮膚提供理論依據(jù)。 研究目的： 1、建

3、立獲得大量高純度的黑色素細(xì)胞和BMSCs的培養(yǎng)方法，并對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)性狀鑒定。 2、探索黑色素細(xì)胞和BMSCs混和培養(yǎng)的方案，并以二者為種子細(xì)胞復(fù)合I型膠原膜體外構(gòu)建含黑色素細(xì)胞的組織工程皮膚。 3、評(píng)價(jià)含黑色素細(xì)胞的組織工程皮膚體內(nèi)移植效果。 研究方法： 1、以包皮組織作為細(xì)胞來源，用消化法獲得表皮細(xì)胞懸液，通過黑色素細(xì)胞完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)篩選，并通過低濃度胰酶消化法進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后對(duì)其進(jìn)行DO

4、PA染色、免疫組化檢測(cè)(S-100蛋白)和透射電鏡觀察，以及生長(zhǎng)曲線的檢測(cè)；同時(shí)進(jìn)行BMSCs的分離培養(yǎng)，對(duì)其表面抗原及其多向分化潛能進(jìn)行鑒定。 2、構(gòu)建I型膠原膜，篩選適合混合培養(yǎng)黑色素細(xì)胞和BMSCs的培養(yǎng)基，確定該兩種細(xì)胞與I型膠原膜復(fù)合構(gòu)建含有黑色素細(xì)胞的組織工程皮膚的方案，并通過免疫組化檢測(cè)(S-100蛋白)和掃描電鏡檢測(cè)構(gòu)建的組織工程皮膚生物學(xué)性狀。 3、建立裸鼠背部皮膚缺損動(dòng)物模型，將體外構(gòu)建的含有色素細(xì)胞

5、的組織工程皮膚移植到裸鼠背部缺損創(chuàng)面，在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)獲取標(biāo)本，通過大體標(biāo)本觀察、DAPI體內(nèi)示蹤標(biāo)記、HE染色、免疫組化檢測(cè)(S-100蛋白)及透射電鏡檢測(cè)等方法觀察組織工程皮膚修復(fù)皮膚創(chuàng)面缺損及生成色素情況。 研究結(jié)果： 1、原代培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞呈多樹突狀，傳至第二代后開始呈現(xiàn)兩極細(xì)尖的長(zhǎng)梭形，S-100蛋白免疫組化染色及DOPA染色為陽性，透射電鏡觀察胞漿內(nèi)含有大量的黑色素小體；通過骨髓獲得的BMSCs原代培養(yǎng)時(shí)最

6、初呈成纖維細(xì)胞樣集落生長(zhǎng)，傳代后形態(tài)均一，呈寬大的長(zhǎng)梭形，擴(kuò)增后的BMSCs不表達(dá)CD34和CD11a；CD29強(qiáng)表達(dá)；CD71僅有微弱表達(dá)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞中80％以上處于G0/G1期，G2/M期占11％，S期的細(xì)胞占7％左右，染色體核型分析為女性正常核型。BMSCs在向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)后第5～6天胞漿內(nèi)就有小的脂滴出現(xiàn)，誘導(dǎo)第2周時(shí)細(xì)胞分化達(dá)高峰，細(xì)胞體積達(dá)到最大，胞質(zhì)內(nèi)脂滴數(shù)量最多。第3周時(shí)進(jìn)行油紅0染色，可見細(xì)胞內(nèi)脂滴被紅染。BMS

7、Cs在向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)第7天后細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生明顯變化，經(jīng)14天誘導(dǎo)后形態(tài)類似成骨細(xì)胞，對(duì)誘導(dǎo)3周的成骨樣細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色，可見細(xì)胞胞體周圍有深淺不一的淺黑色受染區(qū)。BMSCs的S-100蛋白免疫組化染色為陰性。 2、未交聯(lián)的I型膠原膜呈白色海綿狀，抗撕拉能力差，交聯(lián)后的膠原膜為半透明的無色薄膜，柔韌適度，富有彈性，具有一定的抗撕拉能力。在24孔板單孔大小的膠原膜上于第1天種植2×106個(gè)BMSCs，以BMSCs完

8、全培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后第2天種植2×105個(gè)黑色素細(xì)胞，以黑色素細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)可以構(gòu)建出含有混和細(xì)胞的組織工程皮膚；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)黑色素細(xì)胞及BMSCs在膠原膜上可以良好生長(zhǎng)；S-100蛋白的免疫組化可以觀察到種植在組織工程皮膚上的黑色素細(xì)胞呈陽性反應(yīng)。 3、術(shù)后第2周各組皮膚創(chuàng)面開始愈合。大體標(biāo)本觀察兩組含有BMSCs的組織工程皮膚的愈合情況要好于含有單純黑色素細(xì)胞組織工程皮膚組，創(chuàng)面小，血痂少；HE染色可以看到前兩組的表皮

9、結(jié)構(gòu)厚，細(xì)胞排列更為有序；S-100蛋白免疫組化染色可以看到含有黑色素細(xì)胞的兩組組織工程皮膚為陽性反應(yīng)，而含有單純BMSCs的組織工程皮膚組為陰性反應(yīng)。透射電鏡觀察可以看到在成活的組織工程皮膚中含有黑色素細(xì)胞，并且與基底膜之間形成半橋粒連接；表皮細(xì)胞排列整齊，胞質(zhì)含有大量張力細(xì)絲；相鄰的表皮細(xì)胞之間形成橋粒連接。在術(shù)后第1、2周時(shí)可以看到DAPI標(biāo)記的人黑色素細(xì)胞。 研究結(jié)論： 1、通過低濃度胰酶消化培養(yǎng)法可以從人包皮組

10、織中獲得大量高純度生長(zhǎng)狀態(tài)良好的黑色素細(xì)胞；從骨髓中分離得到的BMSCs遺傳性狀穩(wěn)定，具有多向分化潛能，二者可以作為構(gòu)建組織工程皮膚的種子細(xì)胞來源；S-100蛋白免疫組化反應(yīng)可以用來鑒別黑色素細(xì)胞和BMSCs混和生長(zhǎng)的細(xì)胞群中的黑色素細(xì)胞。 2、BMSCs完全培養(yǎng)基和黑色素細(xì)胞完全培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)的前3天內(nèi)可以彼此互相替代；以105個(gè)/cm2級(jí)別的黑色素細(xì)胞和106個(gè)/cm2級(jí)別的BMSCs比例混合與I型膠原膜復(fù)合可以在體外構(gòu)建