馬γ-干擾素單克隆抗體的制備及細(xì)胞免疫評(píng)價(jià)方法的研究.pdf

1、γ-干擾素(IFN－γ)是機(jī)體內(nèi)一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能的重要細(xì)胞因子。研究表明，內(nèi)源性IFN－γ水平的高低在很大程度上可以反映機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)，因此對(duì)樣本中的IFN－γ進(jìn)行定量分析對(duì)免疫機(jī)制研究、免疫功能分析、疫苗免疫效果評(píng)估、器官移植、過(guò)敏反應(yīng)以及多種胞內(nèi)病原感染的診斷等方面都具有極其重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。然而，迄今沒(méi)有應(yīng)用于檢測(cè)馬IFN－γ的單克隆抗體，用以建立相應(yīng)的檢測(cè)方法。本研究旨在建立檢測(cè)馬IFN－γ(Eq

2、uineinterferon－γ，EIFN－γ)抗原捕獲ELISA、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT))等方法，從而為監(jiān)測(cè)馬機(jī)體免疫狀態(tài)、研究機(jī)體感染或免疫過(guò)程中的免疫效應(yīng)及探討相關(guān)免疫機(jī)制等提供技術(shù)平臺(tái)。 為此，本研究在克隆表達(dá)EIFN－γ之后將其免疫小鼠制備了馬IFN－γ單克隆抗體，然后分別對(duì)其進(jìn)行生物素和熒光素(FITC)標(biāo)記制備了生物素標(biāo)記的馬IFN－γ單克隆抗體和FITC標(biāo)記的馬IFN－γ

3、單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上成功建立了檢測(cè)EIFN－γ的相關(guān)免疫學(xué)方法。 首先，從ConA刺激的馬外周血單核細(xì)胞(PBMC)中采用RT－PCR擴(kuò)增獲得含信號(hào)肽的馬IFN－γ的編碼序列，將其克隆至載體pCR2.1－TOPO中。然后以從重組質(zhì)粒pCR－EIFN－γ為模版擴(kuò)增獲得編碼馬IFN－γ成熟蛋白(matureEIFN－γ，mEIFN－γ)的基因，并將其定克隆至原核表達(dá)載體pET－28a(+)。經(jīng)PCR、酶切及序列測(cè)定后所獲得的重組子

4、轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，將其產(chǎn)物進(jìn)行SDS－PAGE分析和Westernblot鑒定。利用表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的重組水泡性口炎病毒(VSV*GFP)作為指示病毒對(duì)所表達(dá)的EIFN－γ進(jìn)行抗病毒活性測(cè)定。結(jié)果表明，mElFN－γ開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)為441bp，編碼146個(gè)氨基酸；其在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)產(chǎn)物以可溶性和包涵體兩種形式存在，重組蛋白相對(duì)分子量約為18ku，且具有免疫反應(yīng)活性。采用Ni＋親

5、和層析對(duì)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的mEIFN－γ在非變性和變性條件下分別進(jìn)行純化，均獲得了高純度的重組馬IFN－γ，且該重組蛋白具有抗病毒活性，其活性單位為1×103AU/mL。 將原核表達(dá)的重組EIFN－γ免疫BALB/c小鼠(Musmusculus)，經(jīng)4次免疫后，取脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，以昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組馬IFN－γ作為檢測(cè)抗原進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)篩選，最終獲得12株能穩(wěn)定分泌抗體的單細(xì)胞克隆

6、株。利用間接免疫熒光(IFA)實(shí)驗(yàn)對(duì)12株單克隆抗體進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，所獲得的12株細(xì)胞分泌的抗體均為針對(duì)EIFN－γ的特異性抗體。單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果顯示，其中4株為IgG1、2株為IgG2a、3株為IgG2b和其余3株為IgM，而且所有12株單克隆抗體的輕鏈均為K鏈。將此12株單克隆抗體分別與兩個(gè)截短表達(dá)的重組馬IFN－γ蛋白(GST-mEIFN－γ(1-84)和GST-mEIFN－γ(80-146))進(jìn)行特異性ELISA檢測(cè)，

7、結(jié)果表明，其中有7株單克隆抗體識(shí)別GST-mEIFN-γ(1-84)，而另5株單克隆抗體與GST-mEIFN－γ(80-146)發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明所獲得的12株單克隆抗體至少針對(duì)兩個(gè)或兩個(gè)以上不同的抗原表位。而且，其中一株單抗(SB10)具有抑制重組EIFN－γ抗病毒活性作用。 將兩株識(shí)別不同表位的抗馬IFN－γ單克隆抗體腹水(A5和SB10)純化后，對(duì)其中一株純化后的單抗(SB10)進(jìn)行生物素標(biāo)記，通過(guò)對(duì)重組EIFN－γ進(jìn)行ELI

8、SA檢測(cè)來(lái)建立馬γ-干擾素雙抗體夾心ELISA。經(jīng)過(guò)方陣滴定實(shí)驗(yàn)確定捕獲抗體的最佳濃度為1μg/mL，檢測(cè)抗體的工作效價(jià)為1:1000。利用建立的方法對(duì)不同稀釋度的重組馬IFN－γ和絲裂原刺激的馬外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，此方法檢測(cè)敏感度達(dá)到1ng/mL，特異性良好。 利用熒光素FITC對(duì)純化后的抗馬IFN－γ單克隆抗體(SB10)進(jìn)行標(biāo)記，制備FITC標(biāo)記的抗EIFN－γ單克隆抗體，然后采用該抗體對(duì)馬外周血單核

9、細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)EIFN－γ單染色，之后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，并且與商品化的FITC標(biāo)記的抗牛IFN-γ單克隆抗體(CC302)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果表明，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗EIFN－γ單抗能夠有效地應(yīng)用于刺激后的馬外周血單核細(xì)胞的胞內(nèi)染色檢測(cè)。 分別將識(shí)別EIFN-γ不同表位的配對(duì)單抗作為捕獲抗體和檢測(cè)抗體，對(duì)經(jīng)刺激的馬PBMC所分泌的IFN－γ進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)，從而建立檢測(cè)馬γ-干擾素ELISPOT方法。經(jīng)過(guò)方陣滴定實(shí)驗(yàn)確定捕獲抗