抗牛γ-干擾素單克隆抗體制備和鑒定.pdf

1、γ-干擾素（IFN-γ）主要是在特定的抗原、有絲分裂原（ConA、PHA）的刺激下由活化T淋巴細胞或NK細胞產(chǎn)生的一類具有廣譜抗病毒、抑制細胞增殖和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學活性的糖蛋白。自Cerretti于1986年首次克隆出乳牛IFN-γ基因后，重組牛IFN-γ（rBoIFN-γ）先后在原核表達系統(tǒng)、真核表達系統(tǒng)、巴斯德畢赤氏酵母系統(tǒng)、牛I型皰疹病毒載體（BHV-1）中成功獲得了表達，并對其免疫學和生物學活性進行了研究。國內(nèi)外關于牛IFN

2、-γ的研究和應用方面的工作已經(jīng)開展很多，但不論是對免疫細胞功能及機體細胞免疫應答方面的研究，還是對疾病狀態(tài)下IFN-γ產(chǎn)生水平的判定，都需要一種簡便、快速的檢測手段。應用牛IFN-γ單克隆抗體作為研究、檢測IFN-γ的手段，在免疫機制的研究、免疫功能檢測等領域具有廣泛的應用。
　　 本研究通過常規(guī)PCR方法從pMD18-T-BoIFN-γ質(zhì)粒中擴增出BoIFN-γ成熟蛋白基因，并將其插入原核表達載體pET30a和pGEX-6p-

3、1中，經(jīng)DNA測序確認后，分別轉化入Rosetta（DE3）pLysS中，經(jīng)IPTG誘導分別表達出約18ku和42ku左右的融合蛋白。以純化的rHis-BoIFN-γ蛋白作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，用純化的rGST-BoIFN-γ蛋白做為檢測抗原，應用淋巴細胞雜交瘤技術，通過間接ELISA方法進行陽性雜交瘤細胞的篩選，共篩選出4株穩(wěn)定分泌抗rBoIFN-γ的單克隆抗體的細胞株，分別命名為3C9、3D10、2C12、5C4，免疫球蛋

4、白類均為IgM，輕鏈為κ鏈；雜交瘤細胞株連續(xù)傳代15次以上及凍存后復蘇，細胞生長狀態(tài)良好，效價穩(wěn)定；腹水效價分別為1:51200、1:51200、1:12800、1:6400。Western blot結果表明，4株單抗均可特異性的識別rGST-BoIFN-γ蛋白，而不與GST標簽蛋白反應。間接ELISA試驗證明，4株單抗只與rBoIFN-γ反應，而不與GST蛋白和rGoIFN-α、rGoIFN-γ、rBoIFN-α等細胞因子發(fā)生交叉反應