牛干擾素誘導蛋白10的原核表達及其單克隆抗體的研制.pdf

1、干擾素誘導蛋白10(interferon-inducible protein-10，IP-10)是抗原提呈細胞經(jīng)細胞因子刺激后分泌的趨化因子，屬于CXC趨化因子家族。IP-10在感染性疾病、自身免疫性疾病、同種異體移植排斥反應(yīng)、腫瘤、慢性炎癥等疾病中可選擇性地募集T淋巴細胞、自然殺傷細胞和單核細胞到損傷部位，發(fā)揮重要的宿主免疫防護作用。最近的研究顯示IP-10表達水平的改變與感染性疾病，包括炎癥性疾病、免疫功能異常與腫瘤的發(fā)展等相關(guān)。I

2、P-10也開始在牛結(jié)核等感染性疾病的診斷中作為重要的生物標志物，其效果也常與γ-干擾素釋放試驗(interferon gamma release assay，IGRA)相比較。有研究表明聯(lián)合檢測IFN-γ和IP-10能提高牛結(jié)核診斷的敏感性。本研究克隆表達了牛IP-10基因并制備了牛IP-10單克隆抗體，為牛結(jié)核的預防與診斷研究提供了重要的生物材料。
　　1.牛IP-10基因的克隆及原核表達
　　用ConA刺激健康奶牛外周血

3、淋巴細胞，并提取細胞總RNA，以RT-PCR方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板成功擴增到所需目的基因。將目的基因分別與表達載體pGEX-6p-1和pET-30a(+)相連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，并進行鑒定。鑒定正確后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，分別構(gòu)建了BL21(DE3)-pGEX-6p-1-BoIP-10口BL21(DE3)-pET-30a-BoIP-10。經(jīng)IPTG誘導表達后的SDS-PAGE分析，出現(xiàn)預期的目的條帶，條帶大小分別

4、為36 kDa和16 kDa左右。通過GST和His免疫親和層析法進行蛋白的純化，Westernblot結(jié)果顯示純化蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，說明2種標簽的重組蛋白rGST-BoIP-10和rHis-BoIP-10均獲得成功表達。
　　2.牛IP-10單克隆抗體的制備與鑒定
　　將純化重組蛋白rHis-BoIP-10免疫6周齡BALB/c小鼠，經(jīng)3次免疫后，運用淋巴細胞雜交瘤技術(shù)融合細胞，以純化重組蛋白rGST-BoIP-1

5、0為檢測原，運用間接ELISA方法篩選陽性克隆，經(jīng)過2次亞克隆后，共獲得8株能穩(wěn)定分泌特異性BoIP-10單抗的雜交瘤細胞株，分別命名為3E11、2A5、1C6、3B12、3E12、2D5、2H8、3A12。亞型鑒定結(jié)果顯示2A5和3E12單抗為IgM亞型，3E11和2D5為IgG2a亞型，2H8的為IgG3亞型，1C6、3B12、3A12為IgG1亞型。間接ELISA測定效價結(jié)果顯示3E11、2A5、3B12、3E12、2H8五株單抗

6、上清效價均不超過6400，其余3株1C6、2D5、3A12上清效價比較高，在1.0×104以上;制備上述單抗腹水，間接ELISA測定其效價，除了2A5的腹水效價比較低，其余7株單抗的腹水效價均在1.0×106以上。間接ELISA還顯示3E11、2A5、2D5、2H8四株單抗與大腸桿菌表達的商品化牛IP-10有較好的反應(yīng)性，2A5、2D5、2H8等3株單抗與畢赤酵母表達的商品化牛IP-10有較好的反應(yīng)性。Western blot結(jié)果顯示所