DcR3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、背景: 食管癌是人類八種最常見的惡性腫瘤之一。在全世界每年新增的30萬病例中，約70％發(fā)生在我國，并且其發(fā)病率仍呈上升趨勢(shì)。食管癌總體預(yù)后不佳，總的2年和5年生存率分別為35％～42％和15％N24％。食管癌主要分為食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)和食管腺癌，而前者占了90％以上。因此，研究ESCC的發(fā)病機(jī)制，尋找其新的診斷和治療靶點(diǎn)，已經(jīng)成為提高食管癌預(yù)防和治療效果的當(dāng)務(wù)之急。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有一對(duì)矛盾貫穿始終，那就是機(jī)體的免疫

2、監(jiān)視和腫瘤的免疫逃逸。而誘導(dǎo)腫瘤特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)和瘤細(xì)胞自身生長停滯或凋亡是機(jī)體用以清除腫瘤細(xì)胞的主要手段。LIGHT及FasL介導(dǎo)的凋亡是體內(nèi)最常見的凋亡模式，在免疫調(diào)節(jié)和腫瘤的免疫監(jiān)視中起著重要作用。DcR3是TNFRSF的一個(gè)新成員。研究發(fā)現(xiàn)，DcR3通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合可以阻斷經(jīng)由其配體FasL、LIGHT以及TLIA所介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的凋亡；同時(shí)DcR3還可抑制免疫應(yīng)答中T細(xì)胞的增殖并影響DCs的分化和成熟，并

3、抑制CD4+T細(xì)胞在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)中的增殖；此外，DcR3還可抑制T細(xì)胞的趨化效應(yīng)，降低T細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞間的相互作用。研究顯示，DcR3 mRNA低表達(dá)于正常人體組織中的胃、脊髓、淋巴結(jié)、肺、脾、結(jié)腸組織及多數(shù)造血細(xì)胞中，而高表達(dá)于胃腸道惡性腫瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤和淋巴瘤等多種惡性腫瘤中。研究證實(shí)，高表達(dá)DcR3是腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視和殺傷的一個(gè)重要機(jī)制，其表達(dá)水平同多種腫瘤的進(jìn)展程度、轉(zhuǎn)移情況、對(duì)化

4、療的抵抗性以及不良預(yù)后有明顯的相關(guān)性。因此，作為一種候選的腫瘤標(biāo)志物和基因治療標(biāo)靶，DcR3目前已經(jīng)成為了腫瘤診斷和治療相關(guān)研究的熱點(diǎn)。研究DcR3 mRNA和蛋白在人ESCC細(xì)胞系和ESCC病人組織標(biāo)本中的表達(dá)情況并分析DcR3的表達(dá)與疾病的侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)乃至預(yù)后間的關(guān)聯(lián)性，將有助于評(píng)價(jià)DcR3作為ESCC的臨床及預(yù)后的分子標(biāo)志的可能性；而探討其表達(dá)調(diào)控的可能機(jī)制則將有助于ESCC腫瘤基因治療靶點(diǎn)的篩選。因此，關(guān)于DcR3在ESCC

5、病人中的高表達(dá)及其相關(guān)機(jī)制的研究對(duì)于該疾病的防治有相當(dāng)重要的意義。 目的: 研究DcR3基因在ESCC病人腫瘤組織和相應(yīng)的遠(yuǎn)癌組織中的表達(dá)情況，分析DcR3基因的表達(dá)與病人臨床病理特征之間的關(guān)系，為評(píng)價(jià)DcR3作為ESCC的臨床及預(yù)后的分子標(biāo)志提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；檢測(cè)DcR3基因啟動(dòng)子和編碼區(qū)的多態(tài)性位點(diǎn)在重慶地區(qū)漢族ESCC人群中的基因型和等位基因頻率，探討DcR3啟動(dòng)子多態(tài)性與ESCC患病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)，篩查與ESCC腫瘤

6、組織中DcR3基因高表達(dá)相關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，為進(jìn)一步研究和分析影響其表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)；檢測(cè)DcR3基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)差異，探討ESCC腫瘤組織DcR3啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)是否參與其表達(dá)調(diào)控；考察DcR3 RNAi對(duì)ESCC腫瘤細(xì)胞的生長能力、侵襲能力和凋亡等方面的影響，初步探討DcR3在人ESCC細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展過程中可能作用和機(jī)制。 方法: 1.收集109例ESCC腫瘤組織和對(duì)應(yīng)的遠(yuǎn)癌組織標(biāo)本，通過半定量逆轉(zhuǎn)

7、錄聚合酶鏈反應(yīng)(Semi-quantitative RT-PCR)檢測(cè)其中DcR3 mRNA表達(dá)情況； 2.運(yùn)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)52例ESCC病人腫瘤組織中DcR3蛋白表達(dá)情況并行半定量分析； 3.選取DcR3基因啟動(dòng)子和編碼區(qū)四個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(-369G/T、-323A/C、-321C/T、147C/T)，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序的方法了解這些多態(tài)位點(diǎn)在重慶地區(qū)正常人群中的頻率分布，檢測(cè)上述多態(tài)位點(diǎn)在ESCC人群中的基因型

8、和等位基因頻率； 4.選擇4對(duì)DcR3 mRNA表達(dá)狀態(tài)有明顯差異的癌及相對(duì)應(yīng)的遠(yuǎn)癌組織標(biāo)本，利用重亞硫酸鹽修飾后測(cè)序法(BSP)檢測(cè)DcR3基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)； 5.構(gòu)建基于miR-30的、靶向DcR3的慢病毒干擾載體； 6.用干擾載體、包裝質(zhì)粒pMD2G及包膜質(zhì)粒psAX2共同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝； 7.通過流式細(xì)胞儀(FACS)感染后的KYSE150細(xì)胞，獲得DcR3 RNAi的ES

9、CC細(xì)胞模型； 8.利用Real-time PCR和Western Blotting檢測(cè)DcR3 RNAi后瘤細(xì)胞上DcR3的表達(dá)情況； 9.繪制體外培養(yǎng)的感染細(xì)胞、對(duì)照細(xì)胞和親本細(xì)胞的生長曲線； 10.通過Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DcR3 RNAi與LIGHT-Fc協(xié)同作用對(duì)瘤細(xì)胞體外侵襲能力的影響； 11.運(yùn)用Tunel試劑盒檢測(cè)DcR3 RNAi與LIGHT-Fc協(xié)同作用對(duì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

10、。 結(jié)果: 1.ESCC腫瘤標(biāo)本中DcR3 mRNA表達(dá)率為73.4％，而遠(yuǎn)癌組織為47,7％(p<0.01)；分析發(fā)現(xiàn)DcR3 mRNA的表達(dá)與病人的性別、年齡、部位和組織分化程度沒有明顯的相關(guān)性，而與腫瘤組織的外侵程度(p<0.05)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(p<0.05)和臨床TNM分期(p<0.05)有較強(qiáng)的相關(guān)性； 2.ESCC腫瘤組織中DcR3蛋白的表達(dá)強(qiáng)弱與mRNA表達(dá)基本一致，DcR3的過表達(dá)率為28

11、.8％；DcR3的過表達(dá)與ESCC病人區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p<0.05)和TNM分期(p<0.05)有明顯的相關(guān)性； 3.重慶地區(qū)漢族人群中-369G/T、-323 A/C、-321C/T三個(gè)位點(diǎn)不存在多態(tài)性；而147C/T位點(diǎn)等位基因C的頻率為43.7％，略高于中國漢族人(39.0％)和日本人(40.0％)。147C/T多態(tài)位點(diǎn)是與重慶地區(qū)漢族人群ESCC易感性相關(guān)聯(lián)的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)，而且該多態(tài)位點(diǎn)的等位基因型C具有顯性遺傳效應(yīng)，攜

12、帶等位基因C的基因型CC和CT的ESCC發(fā)病JxL險(xiǎn)顯著增加(p<0.05)。但該多態(tài)位點(diǎn)與ESCC腫瘤組織中DcR3蛋白的異常高表達(dá)無明顯的相關(guān)性； 4.DcR3陽性的腫瘤組織和DcR3陰性的遠(yuǎn)癌組織，基因的啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)相同，即基因啟動(dòng)子區(qū)所有的CpG位點(diǎn)都呈非甲基化狀態(tài)； 5.成功設(shè)計(jì)并構(gòu)建了基于nuR-30的、靶向DcR3的慢病毒干擾載體；包裝獲得的病毒上清在體外能有效地感染人KYSE150細(xì)胞；

13、6.經(jīng)FACS分選，Western Blotting檢測(cè)證實(shí)載體pPRIME-DcR3.31能有效地抑制瘤細(xì)胞DcR3的蛋白表達(dá)，抑制率為82.6％； 7.DcR3 RNAi對(duì)KYSE150細(xì)胞的體外生長無明顯影響； 8.DcR3 RNAi與LIGHT-Fc協(xié)同能有效地抑制瘤細(xì)胞的體外侵襲能力； 9.DcR3 RNAi明顯促進(jìn)了LIGHT-Fc對(duì)KYSE150細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)。 結(jié)論: ESCC腫瘤

14、組織中DcR3在mRNA和蛋白質(zhì)水平較之對(duì)應(yīng)的遠(yuǎn)癌組織存在明顯的高表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和臨床TNM分期有較強(qiáng)的相關(guān)性。重慶地區(qū)漢族人群中147C/T位點(diǎn)是與ESCC易感性相關(guān)聯(lián)的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)，該位點(diǎn)的等位基因型C具有顯性遺傳效應(yīng)；ESCC病人腫瘤組織中DcR3的異常高表達(dá)與該基因CpG島的甲基化狀態(tài)異常無關(guān)；DcR3 RNAi對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外生長沒有直接的抑制效應(yīng)，但能與LIGHT-Fc協(xié)同，有效地抑制瘤細(xì)胞的體外侵