菟絲子總黃酮對(duì)內(nèi)分泌衰退型小鼠癡呆模型作用以及相關(guān)作用機(jī)制的研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種漸進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病，又被稱為老年癡呆，其主要的臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙[1-3]。流行病學(xué)調(diào)查表明[4]，AD的發(fā)病率也隨著人們的年齡增加而升高，中老年人患老年癡呆的概率越來(lái)越高，這對(duì)家庭和社會(huì)將產(chǎn)生沉重的影響和負(fù)擔(dān)。此病發(fā)病隱匿，并且目前國(guó)內(nèi)外的市場(chǎng)上尚且沒(méi)有根治AD的特效藥[5]。因此研究AD的發(fā)病機(jī)制以及治療AD藥物已刻不容緩。菟絲子，別名吐絲子（Cuscuta

2、chinensis Lam），屬于旋花科菟絲子屬，是中國(guó)的傳統(tǒng)中藥。其主要成分菟絲子總黃酮(total flavonoidsfrom semen cuscutae，TFSC)在改善內(nèi)分泌功能方面的藥理作用顯著，但其有關(guān)預(yù)防女性更年期AD的報(bào)道較少，本研究主要研究菟絲子總黃酮對(duì)內(nèi)分泌衰退型癡呆小鼠的藥理作用以及相關(guān)的作用機(jī)制。
　　目的:
　　研究與探討菟絲子總黃酮(TFSC)對(duì)內(nèi)分泌衰退型癡呆模型小鼠的記憶能力和神經(jīng)細(xì)胞凋亡

3、的影響及其作用機(jī)制。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)中，我們將50只小鼠進(jìn)行隨機(jī)性分組:包括模型組，雌激素對(duì)照組（Estrogen，E2組），TFSC低劑量組，TFSC中劑量組和TFSC高劑量組，每組10只。手術(shù)時(shí)，從小鼠的背部進(jìn)行手術(shù)并切除雌性小鼠的雙側(cè)卵巢。另外，取10只同樣健康的小鼠進(jìn)行手術(shù)，但是僅切開皮膚并縫合，作為假手術(shù)對(duì)照組，進(jìn)而建立內(nèi)分泌衰退型的癡呆小鼠模型。手術(shù)后的第4d，各組小鼠進(jìn)行為期三個(gè)月灌胃給藥。給藥結(jié)束后利用

4、陰道上皮細(xì)胞染色，檢測(cè)模型的建立是否成功;采用Moms水迷宮方法檢查小鼠的行為學(xué)變化;分析天平稱量小鼠子宮重量的變化;利用放射免疫法去檢測(cè)小鼠血清雌激素水平的改變;采用HE染色和尼氏體染色檢測(cè)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)的改變;流式細(xì)胞儀法檢測(cè)各組小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的變化;Western blotting法檢測(cè)各組小鼠的大腦凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量的改變;采用RT-PCR法檢測(cè)各組小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞中凋亡相關(guān)凋亡基因表達(dá)的改變。
　　結(jié)果

5、:
　　1.TFSC對(duì)小鼠子宮重量的影響:與假手術(shù)組和雌激素組組相比較，模型組小鼠子宮重量顯著下降(P＜0.01);與模型組相比，菟絲子總黃酮各劑量組小鼠子宮重量明顯增加，兩者差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。
　　2.伊紅染色檢測(cè)陰道上皮細(xì)胞形態(tài):與假手術(shù)組和雌激素對(duì)照組相比，模型組陰道上皮細(xì)胞無(wú)角質(zhì)化細(xì)胞，細(xì)胞呈圓點(diǎn)狀。與模型組相比，菟絲子總黃酮各劑量組陰道上皮細(xì)胞出現(xiàn)角質(zhì)化細(xì)胞，無(wú)圓點(diǎn)狀細(xì)

6、胞。
　　3.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶:與假手術(shù)組和E2組相比較，模型組小鼠的潛伏逃逸期和游泳路程呈明顯增加趨勢(shì)，穿越平臺(tái)的次數(shù)也大幅度地降低，其差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);連續(xù)用藥三個(gè)月后，與模型組小鼠相比較，TFSC各劑量組的小鼠潛伏逃逸期和游泳路程顯著降低，穿越平臺(tái)的次數(shù)也顯著性升高，兩者差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。
　　4.放射免疫法測(cè)量血清E2含量:與假手術(shù)對(duì)照

7、組和雌激素組相比，模型組各小鼠血清雌激素的含量下降明顯，其差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相比，菟絲子各劑量組血清雌激素水平明顯增加，但與假手術(shù)組相比還有一定差距。兩者差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。
　　5.HE和尼氏體染色檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞病理變化: HE染色的結(jié)果可知:假手術(shù)組小鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目豐富，神經(jīng)元形態(tài)飽滿，排列整齊，核漿明顯，細(xì)胞核呈圓形，核仁較為明顯;模型組小鼠海

8、馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，較多的神經(jīng)元胞體縮小，CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞較多的發(fā)生了核固縮，神經(jīng)元的數(shù)目也顯著減少，胞漿中的空泡大大增加;E2組的小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列較模型組整齊，胞漿空泡較模型組明顯變小，神經(jīng)元數(shù)量顯著增加;高劑量組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較多，排列較模型組整齊，胞漿空泡與模型組相比明顯的變小，神經(jīng)元數(shù)量較模型組有明顯的增加;中劑量組小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列較整齊，神經(jīng)元胞體縮小，核固縮，胞漿空泡變小，神經(jīng)元數(shù)量較模型

9、組有所增加;低劑量組小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列很疏松并且數(shù)目較少，神經(jīng)元胞體顯著縮小，發(fā)生核固縮，胞漿空泡甚至與模型組無(wú)多大區(qū)別。尼氏體染色法:假手術(shù)組小鼠大腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞豐富，排列規(guī)則，尼氏體豐富;模型組小鼠神經(jīng)細(xì)胞排列混亂，尼氏體不清楚，染色不均勻，細(xì)胞腫脹較多，壞死細(xì)胞較多;雌激素組小鼠大腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較多，排列整齊，尼氏體較為豐富，胞漿較豐富，形態(tài)較完整;高劑量組小鼠神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則，數(shù)目較多，尼氏體較為豐富，形態(tài)相比模型

10、組較為完整;中劑量組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較模型組多，部分細(xì)胞發(fā)生腫脹，細(xì)胞染色較均勻;低劑量組小鼠神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較少，排列不規(guī)則，尼氏體不清晰，部分細(xì)胞腫脹，壞死細(xì)胞較多。
　　6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:與假手術(shù)組和雌激素對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率升高顯著，其差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);藥物組小鼠經(jīng)過(guò)灌胃給藥三個(gè)月后，與模型組相比，TFSC各劑量組小鼠的腦細(xì)胞凋亡率呈明顯下降趨勢(shì)，兩者差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

11、義(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。
　　7.Western blot檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白表達(dá):與假手術(shù)組和雌激素對(duì)照組相比，模型組小鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞中的bax蛋白，Cyt-c蛋白和Caspase-3蛋白的表達(dá)增高，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著性下降，其差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);連續(xù)灌胃給藥3個(gè)月后，與模型組相比，TFSC各劑量組的海馬神經(jīng)細(xì)胞中Bax蛋白、Cyt-c蛋白和Caspase-3蛋白的水平呈明顯

12、的下降趨勢(shì)，Bcl-2蛋白的水平呈明顯的上升趨勢(shì)，兩者差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。
　　8.RT-PCR檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞相關(guān)凋亡基因的表達(dá):與假手術(shù)組和雌激素對(duì)照組相比，模型組小鼠海馬區(qū)Bax mRNA和Cyt-c mRNA灰度值增加明顯，表達(dá)顯著升高，蛋白Bcl-2 mRNA條帶灰度值顯著降低，其差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);連續(xù)灌胃給藥3個(gè)月后，與模型組相比，菟絲子總黃酮各劑量組小鼠海馬

13、區(qū)Bax mRNA、Cyt-c mRNA灰度值明顯降低，表達(dá)量顯著下降，Bcl-2mRNA的灰度值增加，上調(diào)了Bcl-2 mRNA表達(dá)，兩者差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.摘除卵巢后，小鼠陰道上皮細(xì)胞角化消失，雌激素水平降低明顯，學(xué)習(xí)記憶功能減退，初步證明內(nèi)分泌衰退型癡呆模型建立成功。
　　2.TFSC可能通過(guò)增強(qiáng)小鼠體內(nèi)地下丘腦-垂體-性腺軸的功能，改善小鼠的內(nèi)分