五氯酚對HeLa細胞的毒性及內(nèi)分泌干擾作用機制初探.pdf

1、近年來，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Environmental endocrine disruptors，EEDs)對人類的危害日益引起公眾和學術界的重視，在國際上已經(jīng)成為毒理學界的研究熱點。五氯酚(Pentachlorophenol，PCP)對水生生物的生長、發(fā)育和繁殖構(gòu)成威脅，破壞了水生生態(tài)系統(tǒng)，并通過食物鏈進入人體，對人體健康有潛在的危害。因此在細胞水平上利用多個評價指標研究PCP對細胞的毒性效應具有重要的意義。到目前為止，PCP的內(nèi)分泌干

2、擾作用的具體機制還不清楚。雌激素受體(ER)有兩種亞型：ERα和ERβ，PCP是通過ERα或ERβ其中一條途徑還是通過這兩條途徑來行使內(nèi)分泌干擾作用至今未有報道。本實驗研究PCP是否通過與ERα結(jié)合來行使內(nèi)分泌干擾作用，為進一步闡述PCP內(nèi)分泌干擾作用的具體機制奠定基礎。實驗分為兩大部分：
　　 第一部分：通過觀察細胞形態(tài)學變化和測定細胞增殖抑制率、細胞DNA損傷以及乳酸脫氫酶(LDH)漏出率、細胞培養(yǎng)液SOD活性變化多項評價指

3、標研究了PCP對HeLa細胞的毒性效應。
　　 通過細胞形態(tài)學觀察，初步確定在10-5mol/L PCP開始對HeLa細胞的形態(tài)學產(chǎn)生影響；然后確定細胞接種的數(shù)目在6000～10000個/孔時，可以很好地反映實驗結(jié)果，為后續(xù)實驗奠定基礎；利用MTT比色法測定PCP對HeLa細胞增殖抑制率的影響，確定了PCP半數(shù)抑制濃度IC50為66.59μmol/L，16.47μmol/L PCP染毒HeLa細胞24 h，細胞增殖抑制顯著，表明

4、線粒體己受到損傷，并且隨著PCP濃度的增加，細胞增殖抑制率增大，線粒體的損傷程度愈高。
　　 應用單細胞凝膠電泳技術研究了6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L PCP染毒24 h和36 h對HeLa細胞DNA的損傷情況。實驗結(jié)果表明，無論染毒24 h還是36 h，三個劑量的PCP均沒有造成HeLa細胞尾部DNA百分率和尾距的顯著增加，提示PCP對HeLa細胞DNA沒有損傷作用。
　　 在4個染毒H

5、eLa細胞時間下(12 h、24 h、36 h、48 h)，12.5μmol/L PCP濃度的細胞LDH漏出率很低，隨著PCP濃度的增加，細胞LDH漏出率逐漸增大，各PCP濃度組與12.5μmol/L PCP濃度組間均存在顯著性的差異(p＜0.05)，200μmol/L PCP使細胞LDH漏出率達到了90％。25μmol/L的PCP已經(jīng)使HeLa細胞膜受到顯著性損傷，在一定的PCP濃度下(實驗濃度25μmol/L PCP和50μmol/

6、LPCP)，染毒時間與HeLa細胞LDH漏出率呈現(xiàn)出一定的時間-效應關系。LDH漏出率是評價PCP對HeLa細胞毒性的敏感指標之一。
　　 實驗研究發(fā)現(xiàn)12.25μmol/L、17.5μmol/L和25μmol/L PCP濃度組與溶劑對照組相比，細胞培養(yǎng)液SOD活性存在顯著性差異(p＜0.05)，并且隨著PCP濃度的增加SOD活性逐漸下降，存在一定的濃度-效應關系。HeLa細胞的4個染毒時間的細胞培養(yǎng)液SOD活性具有顯著性差異(

7、p＜0.05)，具有一定的時間-效應關系。相比細胞LDH漏出率，細胞培養(yǎng)液SOD活性是評價PCP對HeLa細胞毒性的更敏感指標。
　　 第二部分：通過建立的hERα細胞篩選系統(tǒng)，初步研究發(fā)現(xiàn)PCP是一種具有弱雌激素活性的內(nèi)分泌干擾物，PCP可以通過ERα結(jié)合形成配體-受體復合物，發(fā)生構(gòu)象改變并同型二聚體化，同型二聚體化的復合物可以和DNA分子上的雌激素反應元件(ERE)結(jié)合，激活受ERE調(diào)控的熒光素酶基因，熒光素酶基因轉(zhuǎn)錄形成m

8、RNA，mRNA進一步翻譯為熒光素酶(Luciferase，Luc)，通過測定熒光素酶活性可以間接反映PCP的內(nèi)分泌干擾作用。PCP可以和17β-乙炔雌二醇(17β-ethinylestradiol，EE2)競爭結(jié)合ERα，PCP濃度越大競爭結(jié)合ERα的能力越強，同時與EE2共同誘導Luc表達的水平降低。
　　 本實驗結(jié)果表明：PCP染毒HeLa細胞，可以改變細胞形態(tài)，10-4mol/L PCP造成絕大部分的HeLa細胞死亡；P