環(huán)境內(nèi)分泌干擾物二噁英的細(xì)胞毒性作用機(jī)制研究.pdf

1、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)是我國(guó)廣泛存在、危害效應(yīng)十分嚴(yán)重的環(huán)境與食品污染物。目前，EEDs已成為全世界廣泛關(guān)注的安全衛(wèi)生問(wèn)題之一。二嗯英(Dioxin)和多氯聯(lián)苯類(lèi)(PCBs)化合物是目前國(guó)際社會(huì)極為關(guān)注的持久性有機(jī)污染物(POPs)與EEDs。由于它們廣泛分布并共存于環(huán)境中，具有可生物蓄積、難以降解、遠(yuǎn)距離遷移及高毒等特性，已成為環(huán)境毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)；2，3，7，8．四氯二苯并二嗯英(TCDD)是二嗯英類(lèi)物質(zhì)中毒性最大、毒作用最為

2、典型、研究中最具有代表性的物質(zhì)，被公認(rèn)為世界最強(qiáng)的致癌物。它主要來(lái)源于垃圾焚燒，農(nóng)藥、化肥、除草劑等含氯化合物的生產(chǎn)和使用。TCDD化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，在環(huán)境中普遍存在，近年來(lái)相繼發(fā)生了數(shù)起有關(guān)二嗯英污染事件，世界各國(guó)都極為關(guān)注二嗯英對(duì)人類(lèi)健康和環(huán)境安全的潛在威脅。因此，對(duì)TCDD的研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)，對(duì)其作用機(jī)制有了初步的認(rèn)識(shí)，但對(duì)細(xì)胞的毒性作用機(jī)制尚不完全清楚，對(duì)其毒性作用的拮抗研究也報(bào)道較少，致使臨床上還未有有效的診治措施。本研究從

3、體內(nèi)和體外兩個(gè)方面研究了TCDD的毒性作用及其機(jī)制，并就鋅對(duì)TCDD產(chǎn)生毒性效應(yīng)的保護(hù)作用進(jìn)行了初步探討，旨在為進(jìn)一步探索臨床防治措施提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究包括二部分：第一部分TCDD與PCBs聯(lián)合作用對(duì)大鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA的影響
　　 本部分實(shí)驗(yàn)應(yīng)用TCDD和Aroclor1254單獨(dú)及聯(lián)合染毒大鼠，采用堿性單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)TCDD和Aroclor1254對(duì)大鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA完整性的影響，并利用析因設(shè)

4、計(jì)方差分析判定二者對(duì)所檢測(cè)的毒理學(xué)終點(diǎn)是否存在聯(lián)合作用，初步探討了TCDD和Aroclor1254單獨(dú)及聯(lián)合毒性作用及其作用模式，以期為進(jìn)一步研究二(口惡)英與PCBs的聯(lián)合毒性作用提供一定的毒理學(xué)依據(jù)。采用2X2析因設(shè)計(jì)將20只SD大鼠按體重隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組（給予等體積橄欖油）、Aroclor1254單獨(dú)染毒組（10mg/kg）、TCDD單獨(dú)染毒組(10 ug/kg)、聯(lián)合染毒組(Aroclor125410mg/kg+TCDD1

5、0ug/kg)，每天灌胃染毒一次，連續(xù)灌胃6d。末次染毒24h后，取外周血，分離淋巴細(xì)胞。采用堿性單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)（彗星試驗(yàn)）檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷情況，并采用CASP軟件分析各組彗星的尾部DNA百分含量(TailDNA％)、尾長(zhǎng)(Tail Length)、尾矩(Tail Moment)．并利用析因方差分析判定TCDD與Aroclor1254聯(lián)合暴露的聯(lián)合毒性效應(yīng)的作用模式。結(jié)果表明，Aroclor1254單獨(dú)染毒組Tail D

6、NA%、Tail Length、Tail Moment與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；TCDD單獨(dú)染毒組和聯(lián)合染毒組Tail DNA%、Tail Length、Tail Moment與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01)。析因分析結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，TCDD與Aroclor1254聯(lián)合作用對(duì)大鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷的影響為協(xié)同作用。第二部分環(huán)境內(nèi)分泌干擾物二晤英的細(xì)胞毒性作用
　　 本部分研究采用TCDD和

7、氯化鋅同時(shí)作用于HepG2細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性癢(ROS)、抗氧化物質(zhì)的含量和抗氧化酶的活性、一些蛋白表達(dá)的變化及細(xì)胞凋亡情況，探討氧化損傷在TCDD所致的HepG2細(xì)胞毒性效應(yīng)中的作用，并初步探討了鋅對(duì)TCDD所致毒性效應(yīng)的保護(hù)作用，為進(jìn)一步探索臨床防治措施提供理論基礎(chǔ)。分別以不同濃度的TCDD和ZnCI2染毒HepG2細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力；熒光探針DCFH-DA法檢測(cè)ROS:采用TBA法測(cè)定細(xì)胞中脂

8、質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量、采用Beutler改良法測(cè)定細(xì)胞中谷胱甘肽(GSH)含量、采用試劑盒測(cè)定細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性；Hoechst熒光探針檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞DNA完整性；Westem Blot檢測(cè)細(xì)胞細(xì)胞色素P4501A1(CYPIAI)、SODI、SODII和熱休克蛋白70(HSP70)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，TCDD可引起明顯的細(xì)胞毒性效應(yīng)，并呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，表現(xiàn)為：Hep

9、G2細(xì)胞活力受到明顯抑制；各染毒組細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量明顯高于對(duì)照組(p<0.01)、細(xì)胞MDA含量隨TCDD濃度的提高而明顯升高(p<0.05)、細(xì)胞內(nèi)GSH含量明顯減少(p<0.05)、細(xì)胞內(nèi)SOD活性顯著降低(p<0.01)：TCDD能夠引起HepG2細(xì)胞的DNA損傷，尾部DNA百分含量(Tail DNA%)、尾長(zhǎng)(Taillength)、尾矩(Tail moment)隨TCDD染毒濃度提高而增加(p<0.01)；TCDD可誘導(dǎo)H

10、epG2細(xì)胞發(fā)生凋亡；TCDD可誘導(dǎo)細(xì)胞中CYPIAI和HSP70蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（p<0．Ol），并使細(xì)胞中SODI和SODIl蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組（p<0.05）,ZnCl2對(duì)TCDD所致的細(xì)胞毒性效應(yīng)具有明顯的保護(hù)作用，表現(xiàn)為：ZnCl2能明顯增加HepG2細(xì)胞活力；細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量明顯低于對(duì)照組(p<0.01)、細(xì)胞MDA含量明顯降低(p<0.05)、細(xì)胞內(nèi)GSH含量和SOD活性顯著升高(p<0.01)；能明顯減輕

11、TCDD所引起HepG2細(xì)胞的DNA損傷，使Tail DNA%、Tail length、Tailmoment減少(p<0.01)；抑制細(xì)胞的凋亡發(fā)生；使細(xì)胞中CYPIAI和HSP70蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P　　 綜合本研究結(jié)果，在本實(shí)驗(yàn)條件下，可以得到如下結(jié)論：①TCDD可引起大鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA的損傷，TCDD和Aroclor1254

12、聯(lián)合染毒對(duì)大鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA的損傷更為嚴(yán)重。②TCDD能引起HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS過(guò)量產(chǎn)生，同時(shí)降低了細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的能力，誘導(dǎo)CYPIAI和HSP70蛋白表達(dá)升高，使SODⅠ和SODⅡ蛋白表達(dá)降低，并最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、DNA發(fā)生氧化損傷及細(xì)胞凋亡。表明氧化應(yīng)激是TCDD引起細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一。③鋅作為自由基清除劑，對(duì)TCDD所引起的抗氧化防徹系統(tǒng)的破壞及其引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡具有一定的保護(hù)作用。表明鋅是可以作為