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文檔簡介
1、[目的]:
探討慢病毒介導(dǎo)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞應(yīng)用于急性心肌梗死治療的有效性及可行性。
[方法]:
1.采用密度梯度離心法分離約四周齡SD大鼠(Sprague-Dawley rats)的股骨、脛骨、肱骨骨髓中單核細(xì)胞(Mononuclear Cells,MNCs),應(yīng)用差速貼壁法培養(yǎng)細(xì)胞,EGM-2全能培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞分化。
2.光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化及應(yīng)用流式分選儀分選出細(xì)胞
2、表面標(biāo)記CD34及KDR均陽性的細(xì)胞。
3.應(yīng)用流式細(xì)胞儀以CD34+及KDR+作為表面標(biāo)記,鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞。
4.采用構(gòu)建的eGFP標(biāo)記慢病毒載體,以最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)值為100進(jìn)行慢病毒介導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞。采用熒光相差顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率及采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)hTERT mRNA的表達(dá)。
5.急性心肌梗死大鼠模型的構(gòu)建。
6.HE染色法檢測移
3、植細(xì)胞后梗死灶血管新生情況。
7.檢測經(jīng)慢病毒介導(dǎo)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮祖細(xì)胞移植于梗死灶1個月后左室心功能。
[結(jié)論]
1.倒置相差顯微鏡下可見細(xì)胞形態(tài)的改變。剛提取的EPCs呈圓形,4d開始出現(xiàn)少量梭形細(xì)胞,7d時大部分細(xì)胞呈梭形,并呈集落樣生長。14d時頭尾相接,呈線索樣或毛細(xì)血管網(wǎng)樣,或呈典型的“鋪路石”形態(tài)。
2.采用流式細(xì)胞分選儀分選細(xì)胞表面標(biāo)記CD34及KDR均陽性的細(xì)胞為我
4、們實驗所需目的細(xì)胞且能提高EPCs的純度。
3.HE染色法檢測發(fā)現(xiàn)移植經(jīng)慢病毒介導(dǎo)hTERT基因轉(zhuǎn)染的EPCs的心肌再生血管密度較EPCs組大,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
4 hTERT基因組較EPCs組,其左室心功能得到增強(qiáng),且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[結(jié)果]:
1.倒置相差顯微鏡下可見細(xì)胞形態(tài)的改變。剛提取的EPCs呈圓形,4d開始出現(xiàn)少量梭形細(xì)胞,7d時大部分細(xì)胞呈梭形,并呈集落樣生長。14 d時頭
5、尾相接,呈線索樣或毛細(xì)血管網(wǎng)樣,或呈典型的“鋪路石”形態(tài)。
2.采用流式細(xì)胞分選儀分選細(xì)胞表面標(biāo)記CD34及KDR均陽性的細(xì)胞均我們實驗所需目的細(xì)胞且能提高EPCs的純度。
3.HE染色法檢測發(fā)現(xiàn)移植經(jīng)慢病毒介導(dǎo)hTERT基因轉(zhuǎn)染的EPCs的心肌再生血管密度較EPCs組大,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
4 hTERT基因組較EPCs組,其左室心功能得到增強(qiáng),且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[結(jié)論]:
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