人類胰島素樣生長(zhǎng)因子1基因修飾的組織工程生物人工肌肉的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、本文主要從以下四個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 人類胰島素樣生長(zhǎng)因子1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建表達(dá)人類胰島素樣生長(zhǎng)因子(hIGF1)基因的病毒載體及表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的對(duì)照載體,為實(shí)現(xiàn)IGF1基因在大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞中的表達(dá)奠定基礎(chǔ)。
　　方法:將目的基因hIGF1CDNA亞克隆到載體pLgXSN載體上,構(gòu)建重組載體pLg hIGF1SN;同法將目的基因EGFP亞克隆到載體pLgXSN載體上

2、,構(gòu)建重組載體pLg EGFPSN,并通過(guò)酶切,DNA測(cè)序鑒定構(gòu)建載體是否正確。
　　結(jié)果:經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析和DNA測(cè)序分析表明:插入到載體中的IGF1CDNA及EGFP的基因片段和GENBACK公布的序列相符。
　　結(jié)論:表達(dá)人類胰島素樣生長(zhǎng)因子及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的重組載體pLghIGF1SN、pLgEGFPSN構(gòu)建成功。
　　第二部分 人類胰島素樣生長(zhǎng)因子1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝及病毒的制備
　　目的:通過(guò)

3、乒乓轉(zhuǎn)導(dǎo)法對(duì)病毒載體進(jìn)行包裝,為介導(dǎo)人類胰島素樣生長(zhǎng)因子(hIGF1)在成肌細(xì)胞中的表達(dá)獲取高滴度的病毒上清。
　　方法:脂質(zhì)體2000為介導(dǎo),GP+E86和PT67兩種包裝細(xì)胞相互乒乓感染的方法,包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLghIGF1SN, pLgEGFPSN作為對(duì)照監(jiān)測(cè)包裝效果;包裝成功后通過(guò)G418持續(xù)篩選2周,產(chǎn)生穩(wěn)定的病毒生產(chǎn)細(xì)胞線。NIH3T3細(xì)胞法測(cè)定病毒滴度,從中選取高滴度的病毒克隆凍存。
　　結(jié)果:(1)脂質(zhì)體

4、轉(zhuǎn)染后,熒光即時(shí)表達(dá)效率達(dá)30％左右;(2)乒乓感染PT67,24小時(shí)后可見熒光蛋白表達(dá);持續(xù)G418篩選2周后,陽(yáng)性細(xì)胞克隆全部表達(dá)綠色熒光。(3)PLghIGF1SN組病毒滴度最高可達(dá)5×106cfu/ml,滴度明顯高于單純E86包裝法。
　　結(jié)論:乒乓感染法可成功對(duì)PLghIGF1SN進(jìn)行包裝,并能獲取高滴度的病毒上清。
　　第三部分 人類胰島素樣生長(zhǎng)因子1在大鼠成肌細(xì)胞中的表達(dá)及活性觀察
　　目的:建立大鼠骨骼

5、肌成肌細(xì)胞的大批量培養(yǎng)方法,為試驗(yàn)提供足夠的細(xì)胞;實(shí)現(xiàn)hIGF1在成肌細(xì)胞中的表達(dá)并觀察其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法:(1)分別采用消化法及組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞的培養(yǎng), Desmin和Actin抗體對(duì)成肌細(xì)胞的純度進(jìn)行測(cè)定,并觀察其生長(zhǎng)曲線及凍存復(fù)蘇之后的生長(zhǎng)規(guī)律。(2)hIGF1病毒上清感染成肌細(xì)胞,G418篩選2周,獲得抗性成肌細(xì)胞,ELISA檢測(cè)上清中hIGF1的表達(dá)。(3)內(nèi)皮細(xì)胞分組后分別給予OX-L

6、DL及成肌細(xì)胞上清干預(yù),MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力;DAPI細(xì)胞核熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)及細(xì)胞凋亡率,western檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)caspase-3及bcl-2的表達(dá),以驗(yàn)證成肌細(xì)胞分泌的hIGF1的生物活性。
　　結(jié)果:(1)原代培養(yǎng)的成肌細(xì)胞經(jīng)45分鐘差速之后,desmin和actine抗體鑒定顯示純度可達(dá)80%以上。經(jīng)適當(dāng)誘導(dǎo),可分化為肌管;成肌細(xì)胞在培養(yǎng)4天左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,凍存之后復(fù)蘇的成肌細(xì)胞存活率達(dá)50%,短期之內(nèi)能快

7、速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;(2)經(jīng)過(guò)G418篩選2周后,成肌細(xì)胞表達(dá)hIGF1的濃度在30ng/ml左右,總量可以達(dá)到(150-200)ng/2×106/d。未轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞組人類胰島素樣生長(zhǎng)因子I總量在0.18士0.09/2×106/ d。(3)OX-LDL可明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞活力及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,加入成肌細(xì)胞分泌的 hIGF1后,細(xì)胞凋亡率由17.3±1.21%,下降至6.2±0.75%(P<0.05);caspase-3的表達(dá)受抑,bcl-2表

8、達(dá)上調(diào)(P<0.05)。
　　結(jié)論:消化法和組織塊法均可在短期之內(nèi)獲得大量的成肌細(xì)胞,成肌細(xì)胞的純度達(dá)到90%;大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞可成功表達(dá)外源性蛋白質(zhì)hIGF1,并具有生物活性。
　　第四部分 人類胰島素樣生長(zhǎng)因子1修飾的人工肌肉的制備及蛋白質(zhì)表達(dá)
　　目的:構(gòu)建人類胰島素樣生長(zhǎng)因子1修飾的組織工程生物人工肌肉,并使其表達(dá)外源性人類胰島素樣生長(zhǎng)因子1。
　　方法:(1)采用特殊的模型及試劑,使轉(zhuǎn)染成功的成肌細(xì)胞