青稞查爾酮合酶基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、青稞(Hordeum vulgareL var.nudum Hook.F)是我國(guó)青藏高原地區(qū)對(duì)多棱裸粒大麥的統(tǒng)稱，即裸大麥。青稞不僅屬于“三高兩低”（高蛋白、高纖維、高維生素、低脂肪和低糖）食品，更含有豐富的功能活性成分如黃酮類化合物、γ-氨基丁酸、多酚類化合物、B族維生素以及β-葡聚糖等，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)人的身體具有保健作用。隨著人民生活水平的提高，青稞的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值亦受到更加重視。
　　黃酮是植物中一類重要的次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化

2、、清除自由基、提高免疫力、防止骨質(zhì)疏松、保護(hù)肝臟等藥理作用，是人們的理想保健物質(zhì)。黃酮在植物中主要有黃酮、黃酮醇、黃烷酮、異黃酮等十幾類，青稞中主要以黃酮醇為主。查爾酮合酶(CHS)為黃酮代謝途徑的第一個(gè)關(guān)鍵限速酶，廣泛分布在植物界，并且在植物的生長(zhǎng)和適應(yīng)環(huán)境活動(dòng)中起著重要作用，近年來(lái)也成為分子生物學(xué)及植物生理學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。
　　為了了解黃酮代謝途徑中相關(guān)酶基因的作用，本實(shí)驗(yàn)以青稞“94-19-1”為材料，采用同源克隆的方式，

3、克隆出了青稞查爾酮合酶基因的編碼序列(Coding sequence，CDS)全長(zhǎng)，并構(gòu)建載體pET-32a-HvCHS,進(jìn)行原核表達(dá)得到了其融合蛋白。
　　本實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下:
　　1.采用同源克隆的方法獲得了青稞CHS的CDS全長(zhǎng)序列，全長(zhǎng)為1351 bp，該序列包含一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)1197 bp，該ORF編碼398個(gè)氨基酸。序列分析表明:該基因編碼蛋白分子量43.4KDa，等電點(diǎn)為預(yù)測(cè)等電點(diǎn)(PI)為5.

4、92，是酸性蛋白，該酶蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)(Ⅱ)為40.10（大于40），屬于不穩(wěn)定蛋白，預(yù)測(cè)其半衰期為30h，平均親水指數(shù)為-0.090，是親水性蛋白。
　　2.Blastn對(duì)比分析結(jié)果表明:該全長(zhǎng)序列與大麥同源性最高，達(dá)到99％，與普通小麥同源性為91％;與水稻同源性為88％。與玉米同源性為85％;與高粱同源性為78％;與葡萄、矮牽牛、橄欖、馬鈴薯、西紅柿等已知的CHS基因的同源性在65％-74％之間。進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示青稞

5、與單子葉植物的大麥、普通小麥的親緣關(guān)系最近，相對(duì)雙子葉植物如西紅柿等關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　3.使用在線服務(wù)器PHYRE2 Server結(jié)合SOPMA軟件對(duì)HvCHS酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)HvCHS酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(41％)、無(wú)規(guī)則卷曲(12％)、及β-轉(zhuǎn)角(15％)組成。進(jìn)行蛋白質(zhì)的N-糖基化和N-磷酸化預(yù)測(cè)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)糖基化位點(diǎn)，卻具豐富的磷酸化位點(diǎn)，9個(gè)絲氨酸(Ser)、6個(gè)蘇氨酸(Thr)和2個(gè)酪氨酸(Tyr)