百合查爾酮合成酶基因（CHS）及其啟動(dòng)子的克隆與分析.pdf

1、百合是世界五大切花之一，花朵碩大，花色各異，花姿優(yōu)雅，倍受人們的青睞。但是，百合隨著花朵的開(kāi)放而迅速衰老，如何延長(zhǎng)花朵的壽命已成為近年來(lái)科學(xué)家們研究的主要課題之一。在百合切花衰老機(jī)理研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)構(gòu)建百合ACC氧化酶基因的RNA干擾載體，將其轉(zhuǎn)入百合中表達(dá)，將會(huì)明顯達(dá)到延緩其衰老的目的。本研究旨在得到百合花器官中特異、高效表達(dá)的啟動(dòng)子，為載體構(gòu)建提供有效的調(diào)控元件，使外源基因只在花中特異表達(dá)，達(dá)到時(shí)空特異表達(dá)的目的。本研究取得的主要

2、結(jié)果如下： 1.獲得百合查爾酮合成酶基因(CHS)的cDNA片段以東方百合‘sobonne’為材料，提取花瓣組織RNA，根據(jù)Genbank已發(fā)表的查爾酮合成酶基因(CHS)的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)RT-PCR獲得了約900bp的目的片段，經(jīng)克隆測(cè)序，該試驗(yàn)片段長(zhǎng)873bp，與已發(fā)表的百合中CHS基因的同源性達(dá)到91％以上，說(shuō)明克隆的片段屬于查爾酮合成酶基因。該序列已在GenBank上登陸，登陸號(hào)為：DQ471950。

3、 2.獲得了百合查爾酮合成酶基因(CHS)的DNA全長(zhǎng)序列在獲得CHScDNA序列的基礎(chǔ)上，重新設(shè)計(jì)CHS基因的引物，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了大約1300bp的目的片段，經(jīng)克隆測(cè)序后表明，該片段長(zhǎng)1307bp，與已得到的cDNA序列對(duì)比分析，CHS基因DNA序列包含兩個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子。該序列已在GenBank上登陸，登陸號(hào)為：DQ471951。 3.獲得了百合查爾酮合成酶基因(CHS)上游調(diào)控區(qū)本研究比較應(yīng)

4、用了接頭連接PCR和UnevenPCR兩種染色體步移方法對(duì)CHS基因的上游序列進(jìn)行克隆。結(jié)果表明，通過(guò)接頭連接PCR，結(jié)合應(yīng)用了巢式PCR，降落PCR，熱啟動(dòng)PCR和兩步PCR的特點(diǎn)，克隆了約898bp的百合CHS基因的上游調(diào)控序列。在啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)PlantCARE中分析表明，該序列為一條未經(jīng)報(bào)道的新序列，該序列具有花中專(zhuān)一性表達(dá)的基本保守區(qū)‘TACPyAT’，并且具備與轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的TATA盒，輔助轉(zhuǎn)譯的CAAT盒，G盒，CCAAT等