Aquaporin-4基因敲除對氟西汀促神經(jīng)再生的影響.pdf

1、Aquaporin-4基因敲除對氟西汀促海馬神經(jīng)再生的影響水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一類廣泛存在于真核生物細胞膜上、選擇性高效轉(zhuǎn)運水分子的特異孔道，對機體的水液平衡和細胞微環(huán)境的穩(wěn)定發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。其中，水通道蛋白4(aquaporin-4， AOP4)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最豐富的水通道蛋白，主要表達在星形膠質(zhì)細胞上，與腦損傷、腦腫瘤及腦缺血的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。星形膠質(zhì)細胞廣泛參與腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的各個環(huán)節(jié)。它不僅

2、能夠支持神經(jīng)元的存活，導(dǎo)向神經(jīng)元的遷移，調(diào)控神經(jīng)干細胞的增殖，調(diào)節(jié)突觸的形成及其功能，還能在體外發(fā)育成多潛能的、自我更新的神經(jīng)球。而新近的研究表明星形膠質(zhì)細胞家系成員--神經(jīng)干細胞上也表達有豐富的AQP4，而神經(jīng)干細胞更是腦內(nèi)神經(jīng)再生的直接參與者。這些研究結(jié)果提示AQP4不僅是腦內(nèi)一種特異性的水轉(zhuǎn)運孔道，而且可能在神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)中具有重要的作用。 神經(jīng)再生(neurogenesis)是指由神經(jīng)干細胞生成功能性神經(jīng)元的過程，包括神

3、經(jīng)干細胞的增殖、分化、成熟及向神經(jīng)回路整合四個步驟。在大多數(shù)哺乳動物以及人類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，成體神經(jīng)再生主要位于側(cè)腦室下區(qū)(subventricular zone，SVZ)和海馬齒狀回亞顆粒細胞區(qū)(subgranular zone，SGZ)，在皮層、下丘腦、黑質(zhì)、脊髓等腦區(qū)也存在神經(jīng)再生。在腦損傷后這些神經(jīng)干細胞增殖被激活，參與損傷組織的修復(fù)。成體神經(jīng)再生對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的維持具有重要意義。研究顯示，神經(jīng)退行性疾病及多種精神類

4、疾病往往伴隨有神經(jīng)再生的抑制。而促進神經(jīng)再生亦是一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的關(guān)鍵。因此成體神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新思路，即通過作用于影響神經(jīng)再生的多個環(huán)節(jié)，誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)再生，促進損傷后組織結(jié)構(gòu)和功能的重建。目前，神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)機制尚不明確，研究、揭示神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)靶點是當(dāng)今生命科學(xué)研究的難點和熱點。 因此，本文工作應(yīng)用AQP4基因敲除小鼠，給予公認的促神經(jīng)再生藥物氟西汀，在基礎(chǔ)狀態(tài)和慢性中度應(yīng)激(Chron

5、ic mild stress， CMS)致神經(jīng)再生抑制的病理狀態(tài)下觀察AQP4敲除對神經(jīng)再生能力的影響，研究AQP4與神經(jīng)再生的相關(guān)性，為闡明AQP4在神經(jīng)再生調(diào)節(jié)中的重要作用積累學(xué)術(shù)基礎(chǔ)。 目的：從整體、細胞和分子水平研究AQP4敲除對氟西汀促海馬神經(jīng)再生的影響及其機制。 方法：1)連續(xù)4周給予AQP4<'+/+>和AQP4<'-/->CD1小鼠氟西汀(10mg·kg<'-1>·day<'-1>，i.p.)，應(yīng)用陌生環(huán)

6、境禁食和懸尾實驗研究氟西汀對小鼠行為學(xué)的影響；應(yīng)用CMS建立AQP4<'+/+>和AQP4<'-/->小鼠應(yīng)激模型后，連續(xù)4周給予氟西汀(10 mg·kg<'-1>·day<'-1>，i.p.)，應(yīng)用糖水偏愛和懸尾實驗研究氟西汀對動物抑郁樣癥狀的改善情況。2)BrdU免疫組化檢測海馬SGZ神經(jīng)干細胞增殖、存活。GFAP或NeuN免疫熒光表型分析存活的BrdU陽性細胞分化情況。3)[<'3>H]-TdR摻入實驗檢測氟西汀對原代培養(yǎng)的成體A

7、QP4<'+/+>和AQP4<'-/->神經(jīng)干細胞增殖反應(yīng)的影響。4)Western blotting檢測海馬CREB、CaMK IV、ERK磷酸化水平和AQP4表達變化。 結(jié)果：1)連續(xù)4周給予氟西汀(10 mg·kg<'-1>·day<'-1>)能夠顯著降低AQP4<'+/+>CD1小鼠陌生環(huán)境覓食潛伏期，顯著改善AQP4<'+/+>CMS模型小鼠的抑郁樣癥狀；而給予氟西汀對基礎(chǔ)和病理狀態(tài)下AQP4<'-/->CD1小鼠的行

8、為學(xué)均無改善作用。2)AQP4基因敲除不影響基礎(chǔ)狀態(tài)海馬SGZ神經(jīng)干細胞的增殖。連續(xù)4周給予氟西汀能夠顯著促進AQP4<'+/+>小鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖，逆轉(zhuǎn)CMS對小鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖的抑制，而對基礎(chǔ)和病理狀態(tài)下AQP4<'-/->小鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖無促進作用。AQP4敲除對BrdU標(biāo)記的陽性細胞存活的比例和向神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞分化的比例無顯著影響。3)氟西汀0.1 μmol·L-<'1>、1 μmol·L-<'1>能夠顯著促

9、進原代培養(yǎng)的成體AQP4<'+/+>神經(jīng)干細胞增殖，但對AQP4<'-/->神經(jīng)干細胞增殖無促進作用。4)連續(xù)4周給予氟西汀(10 mg·kg<'-1>·day<'-1>)能夠顯著升高基礎(chǔ)和病理狀態(tài)下AQP4<'+/+>小鼠海馬內(nèi)CREB蛋白磷酸化的水平，而對AQP4<'-/->小鼠無顯著影響。對影響CREB磷酸化的上游激酶研究發(fā)現(xiàn)，給予氟西汀能夠顯著升高AQP4<'+/+>小鼠海馬內(nèi)CaMKIV磷酸化水平，而對AQP4<'-/->小鼠

10、無顯著影響。給予氟西汀能夠同時提高AQP4<'+/+>和AQP4<'-/->小鼠海馬內(nèi)總ERK水平，而對ERK磷酸化水平均無影響?；A(chǔ)狀態(tài)下，給予氟西汀對AQP4<'+/+>小鼠海馬內(nèi)AQP4蛋白表達水平無顯著變化。CMS能顯著促使AQP4<'+/+>小鼠海馬內(nèi)AQP4蛋白表達水平的上調(diào)，而給予氟西汀能夠使AQP4蛋白表達恢復(fù)到正常的水平。 結(jié)論：AQP4參與CD1成年鼠海馬神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)，其機制與調(diào)節(jié)CaMKIV-CREB信號