nov基因增強(qiáng)OECs促神經(jīng)再生作用及其差異表達(dá)蛋白分離的研究.pdf

1、與周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system,PNS)的再生和功能恢復(fù)不同,中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)損傷后不能再生.長(zhǎng)期以來(lái),研究者們?cè)囉昧硕喾N方法以促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生,如給予神經(jīng)生長(zhǎng)因子、去除膠質(zhì)瘢痕、移植干細(xì)胞等.此外,基因治療也是一種廣泛應(yīng)用于促CNS再生的方法,在這一過(guò)程中,一些新基因被發(fā)現(xiàn)有著很大的應(yīng)用前景,腎母細(xì)胞瘤過(guò)度表達(dá)基因(Nephroblas

2、toma Overexpression gene,nov)就是其中之一.Nov是1991年發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因,其所編碼產(chǎn)物(NOV蛋白)是一種胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like Growth Factor,IGF)結(jié)合蛋白(IGF- binding protein,IGFBPs),屬于IGF家族的成員.有資料表明nov基因與動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和修復(fù)之間存在一定的關(guān)系,可能參與CNS損傷后的再生和修復(fù)過(guò)程.近年,神經(jīng)科學(xué)工作者

3、在CNS損傷方面的研究中對(duì)又一種膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生了極大的興趣,這種被稱作嗅球成鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells , OECs)的膠質(zhì)細(xì)胞是介于施萬(wàn)氏細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞之間的一類細(xì)胞,在中樞和外周神經(jīng)內(nèi)可具有施萬(wàn)細(xì)胞類似的細(xì)胞內(nèi)成髓鞘功能,在脊髓損傷和神經(jīng)退行性病變中可誘導(dǎo)髓鞘生長(zhǎng).從OECs新功能的發(fā)現(xiàn)至今,它已經(jīng)成為把膠質(zhì)細(xì)胞和CNS再生相聯(lián)系的一個(gè)熱點(diǎn),但是以O(shè)ECs作為受體細(xì)胞攜帶目的基因的研究還少見(jiàn)報(bào)道

4、.基因修飾的OECs移植治療CNS損傷結(jié)合了OECs和nov的共同優(yōu)點(diǎn),具有研究?jī)r(jià)值.為了確定nov對(duì)OECs增殖分化的影響以及nov基因工程化OECs對(duì)CNS再生和功能修復(fù)的影響,把nov基因促進(jìn)中樞的再生與嗅球成鞘細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷作用結(jié)合起來(lái),尋找一種修復(fù)中樞神經(jīng)損傷的新方法,該文就此進(jìn)行了系列研究.(1) 嗅球成鞘細(xì)胞體外取材培養(yǎng)與體外生長(zhǎng)特性,細(xì)胞增殖,活性研究;(2)NOV質(zhì)粒擴(kuò)增、轉(zhuǎn)染和表達(dá),觀察NOV對(duì)OECs增殖分化的作

5、用;(3)nov基因轉(zhuǎn)染前后OECs的雙向電泳分析,尋找差異點(diǎn),為后期差異蛋白鑒定打基礎(chǔ).希望轉(zhuǎn)染后OECs恒定表達(dá)NOV,通過(guò)OECs和NOV的共同作用,可能為CNS再生修復(fù)提供更適合的微環(huán)境.主要結(jié)果如下:1、倒置顯微鏡下,接種24小時(shí)后大部分OECs貼壁呈球狀,周圍有云狀物質(zhì)分布,培養(yǎng)3天后的OECs呈梭狀,主要呈雙極,三極,蹼狀的生長(zhǎng)錐樣結(jié)構(gòu)明顯,2~14天的細(xì)胞純度可達(dá)95﹪以上,且細(xì)胞純度不隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯下降.2、純

6、化后培養(yǎng)2天,細(xì)胞主要呈雙極,三極,細(xì)胞走向基本一致,形態(tài)近似Schwann細(xì)胞,8天時(shí)細(xì)胞走向基本一致.3、OECs免疫細(xì)胞化學(xué)染色及純度檢測(cè):未純化前培養(yǎng)8天,P75免疫反應(yīng)細(xì)胞胞體較突起著色為深,細(xì)胞走向極為不一,純化后培養(yǎng)2天的細(xì)胞幾乎均呈陽(yáng)性,胞膜著色較深,形態(tài)呈三角或條梭狀,細(xì)胞走向不一,背景干凈.4、低溫保存過(guò)的嗅鞘細(xì)胞復(fù)蘇后生長(zhǎng)良好,活性,形態(tài)呈梭形,與凍存前一致.活細(xì)胞數(shù)量達(dá)80﹪以上.5、對(duì)pcDNA3.1-NOV質(zhì)

7、粒擴(kuò)增,對(duì)獲得的cDNA測(cè)序,證明獲得產(chǎn)物完全符合設(shè)計(jì)要求.在此基礎(chǔ)上成功地將其轉(zhuǎn)染到OECs細(xì)胞,用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和 Western-blot方法檢測(cè)到NOV的表達(dá).6、與nov修飾的OECs聯(lián)合培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)有許多DRG細(xì)胞向外遷移,細(xì)胞折光性強(qiáng),突起較長(zhǎng)而纖細(xì),并形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò).未修飾的OECs組只有少量的細(xì)胞遷移和突起生長(zhǎng),細(xì)胞遷移和突起生長(zhǎng)都很局限.空白對(duì)照組DRG僅有細(xì)胞