nov基因增強OECs促神經(jīng)再生作用及其差異表達蛋白分離的研究.pdf

1、與周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system,PNS)的再生和功能恢復(fù)不同,中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)損傷后不能再生.長期以來,研究者們試用了多種方法以促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生,如給予神經(jīng)生長因子、去除膠質(zhì)瘢痕、移植干細胞等.此外,基因治療也是一種廣泛應(yīng)用于促CNS再生的方法,在這一過程中,一些新基因被發(fā)現(xiàn)有著很大的應(yīng)用前景,腎母細胞瘤過度表達基因(Nephroblas

2、toma Overexpression gene,nov)就是其中之一.Nov是1991年發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因,其所編碼產(chǎn)物(NOV蛋白)是一種胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Factor,IGF)結(jié)合蛋白(IGF- binding protein,IGFBPs),屬于IGF家族的成員.有資料表明nov基因與動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和修復(fù)之間存在一定的關(guān)系,可能參與CNS損傷后的再生和修復(fù)過程.近年,神經(jīng)科學工作者

3、在CNS損傷方面的研究中對又一種膠質(zhì)細胞產(chǎn)生了極大的興趣,這種被稱作嗅球成鞘細胞(olfactory ensheathing cells , OECs)的膠質(zhì)細胞是介于施萬氏細胞和星型膠質(zhì)細胞之間的一類細胞,在中樞和外周神經(jīng)內(nèi)可具有施萬細胞類似的細胞內(nèi)成髓鞘功能,在脊髓損傷和神經(jīng)退行性病變中可誘導髓鞘生長.從OECs新功能的發(fā)現(xiàn)至今,它已經(jīng)成為把膠質(zhì)細胞和CNS再生相聯(lián)系的一個熱點,但是以O(shè)ECs作為受體細胞攜帶目的基因的研究還少見報道

4、.基因修飾的OECs移植治療CNS損傷結(jié)合了OECs和nov的共同優(yōu)點,具有研究價值.為了確定nov對OECs增殖分化的影響以及nov基因工程化OECs對CNS再生和功能修復(fù)的影響,把nov基因促進中樞的再生與嗅球成鞘細胞修復(fù)脊髓損傷作用結(jié)合起來,尋找一種修復(fù)中樞神經(jīng)損傷的新方法,該文就此進行了系列研究.(1) 嗅球成鞘細胞體外取材培養(yǎng)與體外生長特性,細胞增殖,活性研究;(2)NOV質(zhì)粒擴增、轉(zhuǎn)染和表達,觀察NOV對OECs增殖分化的作

5、用;(3)nov基因轉(zhuǎn)染前后OECs的雙向電泳分析,尋找差異點,為后期差異蛋白鑒定打基礎(chǔ).希望轉(zhuǎn)染后OECs恒定表達NOV,通過OECs和NOV的共同作用,可能為CNS再生修復(fù)提供更適合的微環(huán)境.主要結(jié)果如下:1、倒置顯微鏡下,接種24小時后大部分OECs貼壁呈球狀,周圍有云狀物質(zhì)分布,培養(yǎng)3天后的OECs呈梭狀,主要呈雙極,三極,蹼狀的生長錐樣結(jié)構(gòu)明顯,2~14天的細胞純度可達95﹪以上,且細胞純度不隨培養(yǎng)時間的延長而明顯下降.2、純

6、化后培養(yǎng)2天,細胞主要呈雙極,三極,細胞走向基本一致,形態(tài)近似Schwann細胞,8天時細胞走向基本一致.3、OECs免疫細胞化學染色及純度檢測:未純化前培養(yǎng)8天,P75免疫反應(yīng)細胞胞體較突起著色為深,細胞走向極為不一,純化后培養(yǎng)2天的細胞幾乎均呈陽性,胞膜著色較深,形態(tài)呈三角或條梭狀,細胞走向不一,背景干凈.4、低溫保存過的嗅鞘細胞復(fù)蘇后生長良好,活性,形態(tài)呈梭形,與凍存前一致.活細胞數(shù)量達80﹪以上.5、對pcDNA3.1-NOV質(zhì)

7、粒擴增,對獲得的cDNA測序,證明獲得產(chǎn)物完全符合設(shè)計要求.在此基礎(chǔ)上成功地將其轉(zhuǎn)染到OECs細胞,用免疫細胞化學技術(shù)和 Western-blot方法檢測到NOV的表達.6、與nov修飾的OECs聯(lián)合培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)有許多DRG細胞向外遷移,細胞折光性強,突起較長而纖細,并形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò).未修飾的OECs組只有少量的細胞遷移和突起生長,細胞遷移和突起生長都很局限.空白對照組DRG僅有細胞