抗氧化中藥的篩選及玉麥須醇提物抗氧化應(yīng)激作用的研究.pdf

1、近年來(lái)，自由基相關(guān)疾病（炎癥、衰老、心血管病、腫瘤等）日益引起人們的關(guān)注。同時(shí)，關(guān)于天然抗氧化劑清除自由基作用的研究也日益深入。尋找并確定抗氧化作用較強(qiáng)的天然抗氧化劑，確認(rèn)其抗氧化作用與防治自由基損傷相關(guān)疾病的關(guān)系，研究其有效成分，對(duì)研發(fā)保健食品或藥品，用于疾病的預(yù)防以及延緩衰老等都有重要意義。
　　本研究分兩部分、4個(gè)層次（包括基因和蛋白水平、亞細(xì)胞水平、細(xì)胞水平和動(dòng)物整體水平）研究了多種中藥醇提物抑制自由基生成、抗氧化應(yīng)激損傷

2、的反應(yīng)特點(diǎn)和作用規(guī)律，發(fā)現(xiàn)玉麥須醇提物具有多層次的抗氧化應(yīng)激損傷作用，并存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，具有很大的開(kāi)發(fā)利用潛能。
　　第一部分為體外和亞細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)利用化學(xué)發(fā)光和微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化模型有效的篩選了11種傳統(tǒng)中藥類抗氧化劑。體外建立了羥自由基和超氧陰離子發(fā)光體系，亞細(xì)胞水平制備了微粒體CHP、Vc/Fe2+、CCl4/NADP+氧化損傷模型。通過(guò)建立的抗氧化劑篩選技術(shù)平臺(tái)，檢測(cè)了11種中藥醇提物對(duì)平臺(tái)各體系激發(fā)生成的自由

3、基及丙二醛含量的影響及其劑量效應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：雖然所選藥物醇提物都有一定的抗氧化作用，但是，首次發(fā)現(xiàn)玉麥須醇提物具有很強(qiáng)的抗氧化作用。玉麥須醇提物(≥3.55μg/ml)可以顯著清除化學(xué)發(fā)光體系產(chǎn)生的?OH和O2?￣，具有明顯的量效關(guān)系，并且活性遠(yuǎn)強(qiáng)于所選的其它中藥提取物。在終濃度為6.25～2000μg/ml內(nèi)，玉麥須醇提物能抑制微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化作用，也存在劑量－效應(yīng)關(guān)系（r≥0.79，P<0.05）。表明玉麥須醇提物具有比較全

4、面、有效、系統(tǒng)的抗氧化作用。
　　第二部分分別以L929細(xì)胞（小鼠肺成纖維細(xì)胞）和BABL/c小鼠作為研究對(duì)象，分為正常對(duì)照組、單純照射組、照射＋低劑量給藥組、照射＋中劑量給藥組、照射＋高劑量給藥組。利用電離輻射產(chǎn)生大量自由基和活性氧，造成實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和動(dòng)物氧化應(yīng)激損傷。
　?。?）細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)：60Co-γ射線20Gy單次照射L929細(xì)胞，照射后立即給藥，給藥終濃度分別為10、50、250μg/mlMSE，并于照射后4h收取細(xì)

5、胞樣品，測(cè)定氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化。結(jié)果表明60Co-γ射線20Gy單次照射能誘發(fā)顯著的自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷反應(yīng)，表現(xiàn)為TBARS升高，GSH含量降低、GSH/GSSH比值降低、CAT、SOD活性明顯降低。給予不同劑量MSE保護(hù)性干預(yù)后，氧化應(yīng)激水平明顯降低，表現(xiàn)為TBARS水平降低，抗氧化酶活性增強(qiáng)，GSH/GSSG比值升高。其中以中劑量MSE組各項(xiàng)指標(biāo)改善明顯，效果最為顯著，同時(shí)發(fā)現(xiàn)高劑量MSE有一定的消耗GSH作用。
　

6、?。?）基因和蛋白表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)：提取氧化損傷的L929細(xì)胞的總RNA，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)CAT、SOD、GGS、Nrf2和TGFβmRNA表達(dá)水平，同時(shí)通過(guò)細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)TGFβ蛋白水平變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：照射后細(xì)胞Nrf2mRNA表達(dá)水平下降，TGFβmRNA和蛋白表達(dá)水平升高，而CAT、SOD、GGSmRNA水平均無(wú)明顯變化。給予MSE干預(yù)后，中劑量組SOD、CAT、TGFβmRNA表達(dá)水平降低，Nrf2、GCSmRNA表達(dá)水平

7、升高，TGFβ蛋白表達(dá)水平降低。低、高劑量組Nrf2、TGFβmRNA表達(dá)水平無(wú)顯著變化，SODmRNA水平升高，CATmRNA水平降低，低劑量組GCSmRNA水平升高，高劑量組降低。
　?。?）動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)：60Co-γ射線5Gy單次照射BABL/c小鼠，照射前一天灌胃給藥，每天一次，一直持續(xù)到觀察終點(diǎn)。給藥濃度分別為75、150、300mg/kg/dMSE。于照射后10天宰殺動(dòng)物，取血清、肝腎勻漿，測(cè)MDA、GSH、GSSH

8、含量，CAT、SOD活性。提取肝臟總蛋白，測(cè)TNFα、SOD、CAT蛋白表達(dá)水平。取全血檢測(cè)WBC、RBC、HGB、PLT變化。做肝腎病理切片，H&E染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低劑量60Co-γ射線照射可以使小鼠全身氧化水平增高，其中以肝臟最為敏感，腎臟最不敏感。給予不同劑量MSE保護(hù)后，肝臟和血清的TBARS含量降低，抗氧化酶活性增高，并呈現(xiàn)出量效關(guān)系。然而，MSE對(duì)肝、血清的GSH、GSSG含量和肝CAT活性無(wú)顯著影響，同時(shí)發(fā)現(xiàn)MSE對(duì)腎

9、組織不僅未表現(xiàn)出保護(hù)作用，低、高劑量MSE還有促TBARS生成作用。肝臟蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，照射組CAT、TNFα表達(dá)均無(wú)變化，SOD表達(dá)下降。給予MSE后，CAT表達(dá)無(wú)改變，中劑量組SOD、TNFα表達(dá)增強(qiáng)，低、高劑量組SOD表達(dá)反而降低。血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示，照射組各項(xiàng)指標(biāo)均顯著下降。除WBC外，給予不同劑量MSE后，指標(biāo)數(shù)值均顯著回升，且量效關(guān)系明顯。
　　本研究結(jié)果提示：化學(xué)發(fā)光和微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化模型是篩選抗氧化劑的高效、