抗氧化中藥的篩選及玉麥須醇提物抗氧化應激作用的研究.pdf

1、近年來，自由基相關疾?。ㄑ装Y、衰老、心血管病、腫瘤等）日益引起人們的關注。同時，關于天然抗氧化劑清除自由基作用的研究也日益深入。尋找并確定抗氧化作用較強的天然抗氧化劑，確認其抗氧化作用與防治自由基損傷相關疾病的關系，研究其有效成分，對研發(fā)保健食品或藥品，用于疾病的預防以及延緩衰老等都有重要意義。
　　本研究分兩部分、4個層次（包括基因和蛋白水平、亞細胞水平、細胞水平和動物整體水平）研究了多種中藥醇提物抑制自由基生成、抗氧化應激損傷

2、的反應特點和作用規(guī)律，發(fā)現(xiàn)玉麥須醇提物具有多層次的抗氧化應激損傷作用，并存在一定的劑量效應關系，具有很大的開發(fā)利用潛能。
　　第一部分為體外和亞細胞水平實驗：實驗利用化學發(fā)光和微粒體脂質(zhì)過氧化模型有效的篩選了11種傳統(tǒng)中藥類抗氧化劑。體外建立了羥自由基和超氧陰離子發(fā)光體系，亞細胞水平制備了微粒體CHP、Vc/Fe2+、CCl4/NADP+氧化損傷模型。通過建立的抗氧化劑篩選技術平臺，檢測了11種中藥醇提物對平臺各體系激發(fā)生成的自由

3、基及丙二醛含量的影響及其劑量效應關系。實驗結果表明：雖然所選藥物醇提物都有一定的抗氧化作用，但是，首次發(fā)現(xiàn)玉麥須醇提物具有很強的抗氧化作用。玉麥須醇提物(≥3.55μg/ml)可以顯著清除化學發(fā)光體系產(chǎn)生的?OH和O2?￣，具有明顯的量效關系，并且活性遠強于所選的其它中藥提取物。在終濃度為6.25～2000μg/ml內(nèi)，玉麥須醇提物能抑制微粒體脂質(zhì)過氧化作用，也存在劑量－效應關系（r≥0.79，P<0.05）。表明玉麥須醇提物具有比較全

4、面、有效、系統(tǒng)的抗氧化作用。
　　第二部分分別以L929細胞（小鼠肺成纖維細胞）和BABL/c小鼠作為研究對象，分為正常對照組、單純照射組、照射＋低劑量給藥組、照射＋中劑量給藥組、照射＋高劑量給藥組。利用電離輻射產(chǎn)生大量自由基和活性氧，造成實驗細胞和動物氧化應激損傷。
　?。?）細胞水平實驗：60Co-γ射線20Gy單次照射L929細胞，照射后立即給藥，給藥終濃度分別為10、50、250μg/mlMSE，并于照射后4h收取細

5、胞樣品，測定氧化應激相關指標的變化。結果表明60Co-γ射線20Gy單次照射能誘發(fā)顯著的自由基介導的氧化應激損傷反應，表現(xiàn)為TBARS升高，GSH含量降低、GSH/GSSH比值降低、CAT、SOD活性明顯降低。給予不同劑量MSE保護性干預后，氧化應激水平明顯降低，表現(xiàn)為TBARS水平降低，抗氧化酶活性增強，GSH/GSSG比值升高。其中以中劑量MSE組各項指標改善明顯，效果最為顯著，同時發(fā)現(xiàn)高劑量MSE有一定的消耗GSH作用。
　

6、　（2）基因和蛋白表達水平實驗：提取氧化損傷的L929細胞的總RNA，通過RT-PCR檢測CAT、SOD、GGS、Nrf2和TGFβmRNA表達水平，同時通過細胞免疫化學檢測TGFβ蛋白水平變化。實驗結果表明：照射后細胞Nrf2mRNA表達水平下降，TGFβmRNA和蛋白表達水平升高，而CAT、SOD、GGSmRNA水平均無明顯變化。給予MSE干預后，中劑量組SOD、CAT、TGFβmRNA表達水平降低，Nrf2、GCSmRNA表達水平

7、升高，TGFβ蛋白表達水平降低。低、高劑量組Nrf2、TGFβmRNA表達水平無顯著變化，SODmRNA水平升高，CATmRNA水平降低，低劑量組GCSmRNA水平升高，高劑量組降低。
　?。?）動物水平的實驗：60Co-γ射線5Gy單次照射BABL/c小鼠，照射前一天灌胃給藥，每天一次，一直持續(xù)到觀察終點。給藥濃度分別為75、150、300mg/kg/dMSE。于照射后10天宰殺動物，取血清、肝腎勻漿，測MDA、GSH、GSSH

8、含量，CAT、SOD活性。提取肝臟總蛋白，測TNFα、SOD、CAT蛋白表達水平。取全血檢測WBC、RBC、HGB、PLT變化。做肝腎病理切片，H&E染色。實驗結果表明，低劑量60Co-γ射線照射可以使小鼠全身氧化水平增高，其中以肝臟最為敏感，腎臟最不敏感。給予不同劑量MSE保護后，肝臟和血清的TBARS含量降低，抗氧化酶活性增高，并呈現(xiàn)出量效關系。然而，MSE對肝、血清的GSH、GSSG含量和肝CAT活性無顯著影響，同時發(fā)現(xiàn)MSE對腎

9、組織不僅未表現(xiàn)出保護作用，低、高劑量MSE還有促TBARS生成作用。肝臟蛋白表達檢測結果顯示，照射組CAT、TNFα表達均無變化，SOD表達下降。給予MSE后，CAT表達無改變，中劑量組SOD、TNFα表達增強，低、高劑量組SOD表達反而降低。血常規(guī)檢測結果顯示，照射組各項指標均顯著下降。除WBC外，給予不同劑量MSE后，指標數(shù)值均顯著回升，且量效關系明顯。
　　本研究結果提示：化學發(fā)光和微粒體脂質(zhì)過氧化模型是篩選抗氧化劑的高效、