17β-雌二醇抗氧化應激誘導大鼠髓核細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的：
　　初步探究雌激素保護氧化應激誘導大鼠髓核細胞凋亡的作用。
　　方法：
　　這項研究的目的是以離體實驗探討雌激素對氧化應激誘導大鼠髓核細胞凋亡的保護作用。為了提取大鼠原代髓核細胞，采用了胰酶消化的方法。為了使培養(yǎng)后貼壁的大鼠髓核細胞有助于傳代，采用了含有0.2％EDTA的胰蛋白酶消化貼壁細胞，使其成為細胞懸浮液，傳代培養(yǎng)。當細胞第3代時，重復傳代步驟，為了減少細胞干預影響，確定實驗分組后培養(yǎng)細胞，采用的細胞培養(yǎng)

2、液中沒有加入胎牛血清和酚紅的DMEM/F12細胞培養(yǎng)液，該實驗按時間先后順序分為三個階段，第一階段實驗分組為，每組為5個樣本。對照組：以不含雙氧水及雌激素的培養(yǎng)液處理；1μm/l組：加入濃度為1μm/l的雙氧水干預；10μm/l組：加入濃度為10μm/l的雙氧水干預，100μm/l組：加入濃度為100μm/l的雙氧水干預，500μm/l組：加入濃度為500μm/l的雙氧水干預，1000μm/l組：加入濃度為1000μm/l的雙氧水干預，

3、第二階段按照作用時間來分組實驗，對照組：以不含雙氧水及雌激素的培養(yǎng)液處理；1小時組：加入濃度為500μm/l的雙氧水作用1小時，3小時組：加入濃度為500μm/l的雙氧水作用3小時，6小時組：加入濃度為500μm/l的雙氧水作用6小時，12小時組：加入濃度為500μm/l的雙氧水作用12小時，24小時組：加入濃度為500μm/l的雙氧水作用24小時，第三階段按照17β-雌二醇的濃度來分組實驗，對照組：以不含雙氧水、雌激素及其抑制劑的培養(yǎng)

4、液處理；凋亡組：加入濃度為500μm/l的雙氧水作用6小時，0.1μm/l組：加入濃度為500μm/l的雙氧水及0.1μm/l的17β-estradiol作用6小時，1μm/l組：加入濃度為500μm/l的雙氧水及1μm/l的17β-estradiol作用6小時，5μm/l組：加入濃度為500μm/l的雙氧水及5μm/l的17β-estradiol作用6小時，10μm/l組：加入濃度為500μm/l的雙氧水及10μm/l的17β-est

5、radiol作用6小時，抑制劑組：加入濃度為500μm/l的雙氧水和10μm/l的17β-estradiol及10μm/l的雌激素抑制劑作用6小時，應用：1大鼠的髓核細胞及染色后細胞核的形態(tài)是用倒置相差顯微鏡及熒光染色來觀察；2乳酸脫氫酶毒性檢測試劑盒檢測乳酸脫氫酶釋放量；3運用CCK-8方法測定細胞增殖活力；4實驗中大鼠髓核細胞凋亡率的檢測，是應用了流式細胞學計數(shù)的方法；5凋亡蛋白caspase-3在各個實驗分組細胞中的表達含量的檢測

6、是采用了western蛋白印跡法；6用實時定量PCR的法來檢測纖維環(huán)細胞中的caspase-3蛋白相關基因表達情況。第一階段，大鼠的髓核細胞分別以濃度為（0,1,10,100,500和1000μm/l）的雙氧水處理，研究雙氧水其細胞毒性作用的劑量依賴性，第二階段，以濃度為500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細胞（1，3，6，12和24小時），研究雙氧水其細胞毒性作用的時間依賴性，第三階段，以濃度為（0,0.1,1,5,10μm/l）的17

7、β-雌二醇處理大鼠髓核細胞研究17β-雌二醇其細胞保護作用的劑量依賴性。
　　結(jié)果：
　　1原代大鼠的髓核細胞在相差倒置顯微鏡下觀察大部分呈現(xiàn)出多角形與長梭形，細胞核熒光染色后在顯微鏡下觀察以圓形以及橢圓形居多，并且可以在細胞的細胞質(zhì)內(nèi)觀察到分泌顆粒，大鼠髓核細胞生長到培養(yǎng)瓶底部貼壁需要大概24到48 h，隨后進入其對數(shù)生長期，再培養(yǎng)7~8 d細胞即可,細胞可傳至6～8代培養(yǎng)。細胞皺縮、空泡形成等凋亡形態(tài)可在雙氧水作用過后的

8、細胞中觀察到，細胞核呈現(xiàn)出皺縮及裂解的形態(tài)。
　　2乳酸脫氫酶毒性檢測試劑盒檢測乳酸脫氫酶釋放量結(jié)果顯示，在濃度依次為1μm/l、10μm/l、100μm/l、500μm/l、1000μm/l雙氧水的條件下，乳酸脫氫酶的釋放量分別為對照組的2.3倍、3.4倍、4.7倍、6.2倍、6.4倍，差異具有統(tǒng)計學意義。即雙氧水引起大鼠髓核細胞乳酸脫氫酶釋放量提高具有時間依賴性，此外與對照組相比較在500μm/l雙氧水條件下細胞經(jīng)過1小時、3

9、小時、6小時、12小時、24小時后細胞乳酸脫氫酶釋放量分別提高到2.6倍、4.5倍、6.7倍、6.8倍、6.9倍。差異具有統(tǒng)計學意義，即雙氧水引起大鼠髓核細胞乳酸脫氫酶釋放量升高具有時間依賴性。以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細胞6小時后，以0.1μm/l、1μm/l、5μm/l、10μm/l的17β-雌二醇處理細胞，與對照組相比其乳酸脫氫酶的釋放量分別為4.9倍、3.4倍、2.2倍、1.3倍。差異具有統(tǒng)計學意義，即17β-雌二醇抗

10、雙氧水引起大鼠髓核細胞內(nèi)乳酸脫氫酶釋放量降低具有劑量依賴性。
　　3運用CCK-8方法測定細胞增殖活力結(jié)果為在濃度依次為1μm/l、10μm/l、100μm/l、500μm/l、1000μm/l雙氧水的條件下，細胞活性分別為對照組的82.17%±0.15%、67.57%±0.23%、48.63%±0.31%、27.53%±0.17%、25.87%±0.25%，差異具有統(tǒng)計學意義。即雙氧水引起大鼠髓核細胞活性降低具有劑量依賴性，此外

11、與對照組相比較在500μm/l雙氧水條件下細胞經(jīng)過1小時、3小時、6小時、12小時、24小時后細胞活性分別為對照組的78.23%±0.09%、46.87%±0.63%、23.56%±0.32%、22.63%±0.22%、21.52%±0.33%。差異具有統(tǒng)計學意義，即雙氧水引起大鼠髓核細胞活性降低具有時間依賴性。以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細胞6小時后，以0.1μm/l、1μm/l、5μm/l、10μm/l的17β-estrad

12、iol處理細胞，與對照組相比其細胞活性分別為32.43%±0.21%、42.37%±0.22%、63.82%±0.35%、86.87%±0.25%。差異具有統(tǒng)計學意義，即17β-雌二醇抗雙氧水引起大鼠髓核細胞活性降低具有劑量依賴性。
　　4大鼠髓核細胞在不同濃度的雙氧水處理下的細胞凋亡率以流式細胞學技術來觀察，結(jié)果顯示，雙氧水在濃度為0μm/l時大鼠髓核細胞的凋亡率為0.71%±0.32%，雙氧水在濃度為1μm/l時大鼠髓核細胞的

13、凋亡率為4.66%±0.33%，雙氧水在濃度為10μm/l時大鼠髓核細胞的凋亡率為8.87%±0.19%，雙氧水在濃度為100μm/l時大鼠髓核細胞的凋亡率為19.62%±0.29%，雙氧水在濃度為500μm/l時大鼠髓核細胞的凋亡率為31.72%±0.31%，差異具有統(tǒng)計學意義。即大鼠纖維環(huán)細胞的凋亡率逐漸升高與雙氧水濃度的上升密切相關。以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細胞1小時大鼠髓核細胞的凋亡率為8.87%±0.25%，以50

14、0μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細胞3小時大鼠髓核細胞的凋亡率為17.97%±0.28%，以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細胞6小時大鼠髓核細胞的凋亡率為23.98%±0.35%，以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細胞12小時大鼠髓核細胞的凋亡率為29.35%±0.34%，以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細胞24小時大鼠髓核細胞的凋亡率為35.20%±0.37%，差異具有統(tǒng)計學意義。即雙氧水引起大鼠髓核細胞的凋亡具有時間依賴性。

15、以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細胞6小時后，以0.1μm/l的17β-雌二醇處理，凋亡率為21.34%±0.35%，以1μm/l的17β-雌二醇處理，凋亡率為14.90%±0.37%，以5μm/l的17β-雌二醇處理，凋亡率為7.71%±0.33%，以10μm/l的17β-雌二醇處理，凋亡率為3.19%±0.30%，差異具有統(tǒng)計學意義。即17β-雌二醇抗雙氧水引起大鼠髓核細胞的凋亡具有劑量依賴性。
　　5凋亡蛋白caspas

16、e-3在各個實驗分組大鼠髓核細胞中的表達含量是用Western blot技術來檢測。其結(jié)果顯示：當對照組、雙氧水濃度依次為1μm/l、10μm/l、100μm/l、500μm/l、1000μm/l時的灰度值（/GAPDH）分別為：0.16±0.03、0.24±0.02、0.32±0.02、0.39±0.03、0.41±0.04。其組間差異具有統(tǒng)計學意義。與對照組相比較在500μm/l雙氧水條件下細胞經(jīng)過1小時、3小時、6小時、12小時、

17、24小時后的灰度值（/GAPDH）分別為：0.17±0.03、0.25±0.02、0.37±0.02、0.38±0.03、0.40±0.04。差異具有統(tǒng)計學意義，即雙氧水引起大鼠髓核細胞活性降低具有時間依賴性。以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細胞6小時后，以0.1μm/l、1μm/l、5μm/l、10μm/l的17β-雌二醇處理細胞，與對照組相比其灰度值（/GAPDH）分別為：0.32±0.02、0.23±0.02、0.13±0.0

18、2、0.09±0.03。差異具有統(tǒng)計學意義。
　　6轉(zhuǎn)錄凋亡蛋白caspase-3的基因表達含量運用了實時定量PCR檢測，結(jié)果顯示，當對照組、雙氧水濃度依次為1μm/l、10μm/l、100μm/l、500μm/l、1000μm/l時的相對ct值（/GAPDH）分別為：0.25±0.03、0.43±0.02、0.65±0.02、1.01±0.03、1.07±0.04。其組間差異具有統(tǒng)計學意義。與對照組相比較在500μm/l雙氧水條

19、件下細胞經(jīng)過1小時、3小時、6小時、12小時、24小時后的相對ct值（/GAPDH）分別為：0.42±0.03、0.61±0.02、0.92±0.02、1.08±0.03、1.12±0.04。差異具有統(tǒng)計學意義。以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細胞6小時后，以0.1μm/l、1μm/l、5μm/l、10μm/l的17β-雌二醇處理細胞，與對照組相比其相對ct值（/GAPDH）分別為：0.79±0.02、0.58±0.02、0.41±