DJ-1在黑素細胞抗氧化應激中的作用研究.pdf

1、白癜風是一種臨床上常見的色素脫失性皮膚病，其發(fā)病機制目前仍不完全清楚，其中涉及遺傳背景、氧化應激、自身免疫、精神神經(jīng)等多種因素。近年來研究發(fā)現(xiàn)氧化應激在白癜風發(fā)病中發(fā)揮重要作用。
　　正常情況下，皮膚氧化-抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，而白癜風患者中這一平衡被打破。有學者發(fā)現(xiàn)，在進展期白癜風患者表皮中H2O2濃度可高達為10-3M，遠遠高于正常人的10-7M-10-6M生理濃度。高濃度的H2O2誘導了白癜風的發(fā)生并促進了白癜風的發(fā)展

2、。
　　DJ-1/PARK7基因編碼DJ-1蛋白，發(fā)現(xiàn)于1997年，曾被認為是癌基因。目前的研究發(fā)現(xiàn)其具有多種生物學功能：包括促進細胞增殖，參與雄性精子成熟與受精，抵抗氧化應激等。隨著研究的深入，其抗氧化應激功能日益被重視。但DJ-1在黑素細胞中是否表達及其功能如何尚未見報道。
　　本試驗以人原代培養(yǎng)黑素細胞為對象，采用H2O2誘導氧化應激和siRNA干涉技術(shù)觀察DJ-1基因?qū)毎螒B(tài)、增殖活力、細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生及凋亡的影響

3、，以驗證其對黑素細胞是否具有抗氧化應激保護作用。
　　第一部分實驗：DJ-1在黑素細胞內(nèi)的表達鑒定、H2O2適宜濃度及DJ-1特異性有效siRNA序列篩選
　　1.主要方法
　　采用免疫熒光方法鑒定DJ-1在原代培養(yǎng)黑素細胞中的表達；使用不同濃度H2O2處理黑素細胞24h，改良MTT法檢測細胞活性，選取適宜濃度H2O2作為后續(xù)實驗條件；設(shè)計并合成三對DJ-1特異性siRNA，反向轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)人黑素細胞，實驗分組包括空白

4、對照組（不含siRNA），陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA-negativecontrol）及實驗組（轉(zhuǎn)染siRNA-DJ-1），于轉(zhuǎn)染后24h及48h分別行Q-RT-PCR及Westernblot檢測DJ-1mRNA及蛋白表達情況，篩選干涉效率最高的siRNA片段。
　　2．主要結(jié)果
　　免疫熒光顯示DJ-1在細胞核和胞質(zhì)中均表達，以細胞核表達為主；細胞活力隨H2O2濃度增高呈劑量依賴關(guān)系下降，0.5mMH2O2處理24

5、h后，細胞活力開始下降(P<0.05vscontrol)，此濃度作為誘導氧化應激的實驗條件；Q-RT-PCR及Westernblot結(jié)果顯示siRNA-DJ-1-687對靶基因的抑制效果最好。與對照組相比，轉(zhuǎn)染了DJ-1-siRNA-687的細胞組DJ-1mRNA及蛋白表達量均明顯降低(P<0.05vscontrol)。
　　3.主要結(jié)論
　　本部分實驗證實DJ-1表達于人黑素細胞中，篩選出了適宜處理濃度的H2O2及最有效的

6、siRNA-DJ-1序列，為后續(xù)的實驗打下基礎(chǔ)。
　　第二部分實驗：DJ-1通過降低細胞內(nèi)ROS和抑制細胞凋亡保護黑素細胞抵抗H2O2誘導的氧化應激損傷
　　1.主要方法
　　用0.5mMH2O2處理黑素細胞24h后，Q-RT-PCR和Westernblot檢測DJ-1mRNA和蛋白表達變化情況；使用siRNA-DJ-1-687反向轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)黑素細胞，設(shè)空白對照組（不含siRNA），陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA

7、-NC）及實驗組（轉(zhuǎn)染siRNA-DJ-1）。細胞貼壁后，光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)學差異；轉(zhuǎn)染48h后，使用0.5mM的H2O2處理三組黑素細胞24h，改良MTT法、熒光探針2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)、膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)分別檢測細胞活力變化、細胞內(nèi)活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)水平及細胞凋亡比例。
　　2.主要結(jié)果
　　0

8、.5mMH2O2處理細胞24h后，處理組DJ-1表達增高為對照的2.23倍(P<0.05vsuntreated)；干涉DJ-1表達，細胞貼壁后，siRNA-DJ-1組黑素細胞形態(tài)與對照組相比，樹突減少縮短，胞漿空泡化改變；使用0.5mMH2O2處理24h后，siRNA-DJ-1組細胞活力為對照組的35％(P<0.05vscontrol)；細胞內(nèi)ROS的fluorescenceintensity(FI)值(902±40)和凋亡比例(58％

9、±6.1％)增高，與對照組細胞內(nèi)ROS的FI值(529±32)和凋亡比例(30％±3.8％)相比，P值均<0.05；
　　3.主要結(jié)論
　　我們的研究證實在H2O2所誘導的氧化應激下黑素細胞中DJ-1表達增高，從而發(fā)揮其保護作用，DJ-1在黑素細胞中能夠通過降低細胞內(nèi)ROS水平和抑制細胞凋亡來抵抗H2O2所誘導的氧化應激損傷。此外，即使在無外源性氧化應激存在時，DJ-1表達被抑制后黑素細胞出現(xiàn)樹突縮短、空泡化等改變，提示DJ