微囊化豬虹膜色素上皮細(xì)胞紋狀體移植治療帕金森病大鼠的實驗研究.pdf

1、帕金森病(Parinson′s disease，PD)是以黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元變性為特征的疾病，細(xì)胞移植是有前景的治療方法。尋找合適的供體細(xì)胞是PD細(xì)胞移植的關(guān)鍵問題之一。 虹膜色素上皮細(xì)胞(iris pigment epithelium,IPE)在解剖結(jié)構(gòu)上和睫狀體上皮細(xì)胞等相連，為單層上皮細(xì)胞，其下可見基底膜，可與基質(zhì)分離。近年來發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的IPE含有多種生長因子，如堿性成纖維細(xì)胞生長因子，膠質(zhì)源性神經(jīng)生長因子，腦源性神經(jīng)生長

2、因子，色素上皮生長因子等。這些生長因子對于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞的生長和發(fā)育有一定作用。雖然目前未見IPE細(xì)胞分泌多巴胺的報道，但是IPE細(xì)胞胞漿中含有黑色素顆粒，考慮到多巴胺和黑色素的產(chǎn)生有著共同的通路，所以我們檢測了體外培養(yǎng)的IPE細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)IPE細(xì)胞可以分泌多巴胺和多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，并可以結(jié)合鐵離子，所以我們認(rèn)為IPE細(xì)胞可以作為帕金森病移植治療的細(xì)胞來源。 免疫排斥是細(xì)胞移植的難題，海藻酸鈉—多聚賴氨酸是一種生物相容

3、性良好的半透膜材料，用它來包裹移植物可以很好起到免疫隔離的作用。 本實驗旨在：1．詳細(xì)研究豬IPE細(xì)胞體外多巴胺及神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌特性。觀察失去光線刺激的外環(huán)境是否會影響其功能，為其下一步的移植奠定基礎(chǔ)。2．將該細(xì)胞用海藻酸鈉—多聚賴氨酸包裹制作成微囊后，觀察微囊包裹對細(xì)胞活性和其分泌特性的影響。3．將微囊包裹后的IPE細(xì)胞立體定向植入PD大鼠模型的紋狀體，觀察移植后療效。 第一部分豬IPE細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)及鑒定

4、 目的：建立穩(wěn)定的豬IPE細(xì)胞原代培養(yǎng)、純化及鑒定方法。 方法：酶消化法獲取豬IPE細(xì)胞，純化及傳代后，觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀況；繪制細(xì)胞生長曲線；免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定細(xì)胞：細(xì)胞角蛋白(cytokeratin)和S—100的表達(dá)，統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)，分別計算原代和傳代后陽性細(xì)胞率。結(jié)果：細(xì)胞胞漿內(nèi)含有大量黑色素顆粒；細(xì)胞經(jīng)純化、傳代后，cytokeratin和S—100表達(dá)陽性率均較原代提高，P<0.05；細(xì)胞生長曲線顯示：傳代后

5、第2～3天為指數(shù)生長期，3天以后為平臺期。 第二部分豬IPE細(xì)胞體外生物學(xué)特性研究 目的：觀察豬IPE細(xì)胞體外DA、神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌特性和鐵結(jié)合能力，以及失去光照的環(huán)境是否對IPE細(xì)胞功能產(chǎn)生影響。 方法：收集第1、2、3、4、5、6代IPE細(xì)胞傳代后48h的培養(yǎng)上清液，高效液相色譜-電化學(xué)法(HPLC)檢測樣品中的DA含量；第2代IPE細(xì)胞分為正常培養(yǎng)組、光照組和遮光組，收集各組傳代后第4，8，12，24，3

6、6，48，60，72h的培養(yǎng)上清液，HPLC 法測定DA 含量；ELISA法檢測BDNF、GDNF、NT-3和NGF的分泌量；并測定IPE細(xì)胞結(jié)合鐵的能力。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測IPE細(xì)胞中TH的表達(dá)；RT-PCR方法檢測該細(xì)胞中TH mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：第2代IPE細(xì)胞在傳代后4h開始檢測到多巴胺的分泌，分泌量在48h達(dá)高峰，以后緩慢下降并趨穩(wěn)定；GDNF、BDNF、NT-3和 NGF的分泌以及鐵結(jié)合力較為恒定，隨著培養(yǎng)時間的

7、延長，并沒有明顯變化。傳代后各代IPE細(xì)胞DA分泌量無顯著區(qū)別；光照組的DA分泌在前16小時和其他兩組無差別，16小時后的DA分泌明顯高于其他兩組(P<0.05)。HVA、GDNF、BDNF、NGF和NT-13的分泌在各組之間沒有明顯差別(P>0.05)。遮光組的鐵結(jié)合力似乎低于其他兩組，但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測到IPE細(xì)胞中有TH的表達(dá)；RT-PCR方法檢測到IPE細(xì)胞內(nèi)有TH mRNA的表達(dá)。 第三部分海藻酸鈉

8、微囊的制作及微囊對IPE細(xì)胞生物活性的影響 目的：優(yōu)化適合IPE細(xì)胞的微囊制作條件。觀察微囊化對細(xì)胞分裂以及DA、神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌情況的影響。 方法：應(yīng)用高壓靜電式微囊成型裝置制備海藻酸鈉-多聚賴氨酸微囊化細(xì)胞，摸索最適合的制備參數(shù)；顯微鏡下觀察微囊的形態(tài)，并測量微囊的直徑，用移植所用的針頭來回抽吸微囊觀察其強(qiáng)度；顯微鏡下觀察囊內(nèi)細(xì)胞的生長狀況，并在第0、3、6、9、12天破囊后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并用臺盼蘭染色法檢測囊內(nèi)細(xì)胞存

9、活率；將微囊化和非微囊化兩組細(xì)胞在接種后第1～6天收集培養(yǎng)上清液，檢測其中DA、HVA、BDNF、GDNF、NGF以及NT-3的量，觀察微囊包裹對其分泌特性的影響，并檢測鐵結(jié)合力。 結(jié)果：制備微囊的最佳參數(shù)為：室溫18～20℃，內(nèi)層海藻酸鈉濃度為2.4％，外層海藻酸鈉濃度為0.24％，液面高度為22～25mm，成囊電壓為3.28kv；微囊形態(tài)接近正圓，表面光滑，大小均一，直徑為：275±23gm。微囊經(jīng)針頭抽吸后未見破損；微囊內(nèi)

10、細(xì)胞的總數(shù)沒有明顯變化；細(xì)胞微囊化后培養(yǎng)60h內(nèi)，微囊組的DA分泌與非微囊組相比明顯增加；60h以后，二者無顯著差異。微囊內(nèi)細(xì)胞HVA、BDNF、GDNF、NGF、NT-3的分泌量與非微囊組細(xì)胞相比無顯著差異。鐵結(jié)合力二組之間沒有顯著性差別。 第四部分 PD大鼠模型的建立及IPE細(xì)胞的移植 目的：建立穩(wěn)定的6-OHDA毀損的偏側(cè)PD大鼠模型，確立可靠的行為學(xué)評價指標(biāo)。觀察微囊化IPE細(xì)胞移植到模型大鼠紋狀體的療效。

11、 方法：1．模型的制備及鑒定：6-OHDA毀損內(nèi)側(cè)前腦束(medial forebrain bundle,MFB)建立PD大鼠模型，通過旋轉(zhuǎn)試驗、組織病理證實，并評價其它行為學(xué)指標(biāo)是否有效。2．移植分組：分為IPE細(xì)胞+微囊組；空微囊組；單純手術(shù)損傷組，進(jìn)行右側(cè)紋狀體兩點立體定向移植，分別植入2×10<'4>個IPE細(xì)胞、約280個含細(xì)胞的微囊，相應(yīng)的對照組注射等量的生理鹽水和空微囊。3．移植后的檢測：觀察移植后大鼠旋轉(zhuǎn)行為以及其他行

12、為學(xué)指標(biāo)的變化；HPLC法測定各組紋狀體區(qū)DA和HVA的含量。移植后第12周，取大鼠腦進(jìn)行TH的免疫組化染色。提取移植區(qū)周圍組織的蛋白，電泳后觀察移植物是否影響移植區(qū)周圍腦組織的蛋白合成。 結(jié)果：1．大鼠模型經(jīng)旋轉(zhuǎn)試驗、組織病理鑒定模型成功。2．行為學(xué)指標(biāo)：調(diào)整步態(tài)、啟動時間、單足運(yùn)動的步距和速度是有效的行為學(xué)指標(biāo)，自由運(yùn)動的步距和速度不適合作為PD大鼠模型的行為學(xué)評價指標(biāo)。3．移植后IPE+微囊組：33％的大鼠(10只)旋轉(zhuǎn)行

13、為在移植后第1周開始逐漸改善，至第4周改善更加明顯(與其他組相比，P<0.05)，幾乎不旋轉(zhuǎn)，一直持續(xù)到本試驗結(jié)束(第12周)。二次移植治療的大鼠從第二次治療的時間開始計算，仍有20％的大鼠(4只)有效?？偟挠嬎悖屑s47％的大鼠(14只)治療有效。這些出現(xiàn)療效的大鼠的調(diào)整步態(tài)、啟動時間、單足運(yùn)動的步距和速度均明顯改善。其他兩組移植后行為學(xué)無明顯改善。各組移植后紋狀體 DA 含量的變化同其行為學(xué)改善相符合。4．組織免疫化學(xué)發(fā)現(xiàn)大部分微囊

14、形態(tài)不規(guī)則，囊壁皺縮，但囊壁完整、未見破損。微囊內(nèi)可見散在的圓形細(xì)胞。行為學(xué)得到改善的大鼠紋狀體TH染色顯示囊內(nèi)細(xì)胞呈陽性，微囊周邊的紋狀體可見TH陽性纖維密度較空微囊組和單純損傷組明顯增高。5．移植區(qū)周圍組織的蛋白和對側(cè)相比沒有明顯差別。6．IPE+微囊組中有1只大鼠移植后2周左右出現(xiàn)嚴(yán)重的扭轉(zhuǎn)痙攣，解剖后發(fā)現(xiàn)形成腫瘤樣組織。 結(jié)論 1．豬IPE細(xì)胞取材方便，易于分離、純化，體外生長、增殖活躍。機(jī)械-酶消化法獲得的細(xì)胞

15、經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定證實為IPE細(xì)胞，傳代后細(xì)胞純度提高。 2．豬IPE細(xì)胞體外基礎(chǔ)狀態(tài)下即能分泌少量DA、GDNF、BDNF、NT-3和NGF，并具有結(jié)合鐵的能力。這些功能不受傳代的影響。光照會使DA分泌增加，其它功能不受影響。IPE細(xì)胞中還檢測到TH mRNA及蛋白的表達(dá)。 3．用高壓靜電微囊成型裝置制備的APA微囊形態(tài)、大小、均勻度及強(qiáng)度均十分理想。微囊內(nèi)的細(xì)胞不增殖。IPE細(xì)胞的 DA、GDNF、BDNF、NT-3