人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞治療帕金森病的實(shí)驗(yàn)與臨床研究.pdf

1、目的：探討人視網(wǎng)膜色素上皮(humanretinalpigmentepithelium，hRPE)細(xì)胞移植治療帕金森病(Parkinsondisease，PD)的有效方法。方法：將胚胎來源的hRPE細(xì)胞植入PD大鼠紋狀體，根據(jù)移植前后大鼠行為學(xué)、影像學(xué)和組織學(xué)改變評估移植治療效果。將眼庫來源的hRPE細(xì)胞植入12例PD病人殼核后部，根據(jù)術(shù)前術(shù)后CAPIT評分和PET影像變化確定療效。結(jié)果：hRPE細(xì)胞移植后PD大鼠行為學(xué)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)明顯

2、改善，PET掃描在體顯示hRPE細(xì)胞分泌多巴胺，具有較好的移植治療效果。12例PD患者移植手術(shù)經(jīng)過順利，無嚴(yán)重并發(fā)癥，也無明顯免疫排斥反應(yīng)。術(shù)后1個月均出現(xiàn)癥狀改善，其中11例患者在術(shù)后3個月時，癥狀進(jìn)一步改善，PET掃描提示，從術(shù)后1月始，移植區(qū)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DAT)逐步增加。結(jié)論：hRPE有希望成為神經(jīng)細(xì)胞移植的理想供體來源，有關(guān)移植治療的長期療效還有待進(jìn)一步觀察和總結(jié)。 帕金森病(Parkinsondisease，PD)

3、的主要病理表現(xiàn)是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性潰變，而導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺含量的減少。根據(jù)這一病理特點(diǎn)所采用的神經(jīng)細(xì)胞移植治療策略是目前治療的新進(jìn)展之一。它將能產(chǎn)生多巴胺神經(jīng)元的外源性的神經(jīng)干細(xì)胞利用立體定向技術(shù)導(dǎo)入腦內(nèi)，補(bǔ)充喪失的多巴胺神經(jīng)元，并重建神經(jīng)環(huán)路。這一策略的治療潛能正越來越引起人們的重視。為了及時的將這一新理論與成果付諸于PD的治療研究，全面系統(tǒng)的動物實(shí)驗(yàn)和臨床前期試驗(yàn)，無疑將為臨床的最終應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4、第一部分：人胚胎視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定目的：探索人胚胎視網(wǎng)膜色素上皮(humanretinalpigmentepitheial，hRPE)細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，并進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞特異性鑒定，為下一步的移植提供可靠來源的細(xì)胞。 材料和方法：從孕10～20周自然流產(chǎn)的人胚胎眼球中分離出hRPE細(xì)胞，在DMEM/F12培養(yǎng)基中，添加10％胚胎牛血清，20ng/ml的EGF，20ng/ml的bFGF，10ng/ml的LIF進(jìn)行擴(kuò)增。每3

5、～5天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞生長至95％融合時，0.25％胰蛋白酶消化傳代，傳代5～10代后用于實(shí)驗(yàn)研究。培養(yǎng)出的hRPE細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀、G顯帶染色體分析、體外誘導(dǎo)分化、逆轉(zhuǎn)錄PCR分析及免疫熒光染色方法進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞特異性鑒定。 結(jié)果：hRPE細(xì)胞在該條件下，可以比較穩(wěn)定的在體外擴(kuò)增。原始hRPE細(xì)胞形態(tài)為小圓形，有的細(xì)胞胞漿中殘留黑色素顆粒。傳代后成紡錘形，有的細(xì)胞形成軸突，hRPE細(xì)胞具有神經(jīng)干細(xì)胞的特征，并能在一定的條件下分

6、化為多巴胺能神經(jīng)元。 結(jié)論：hRPE細(xì)胞具有神經(jīng)干細(xì)胞的特征，并能在一定條件下轉(zhuǎn)化為多巴胺能神經(jīng)元，有望成為PD移植治療的理想細(xì)胞來源。 第二部分：偏側(cè)PD大鼠模型的建立目的：采用立體定向腦內(nèi)注射6-羥基多巴將(6-OHDA)的方法制備偏側(cè)大鼠PD模型，為下一步神經(jīng)干細(xì)胞移植治療實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定的PD嚙齒類動物模型，。 材料和方法：30只SD大鼠，體重230±20g。將6-羥基多巴(6-OHDA)立體定向注入大鼠右側(cè)

7、前腦內(nèi)側(cè)束(MFB)和中腦被蓋腹側(cè)區(qū)(VTA)，術(shù)前術(shù)后均進(jìn)行行為學(xué)測試，即阿樸嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。3個月后，處死大鼠，取兩側(cè)黑質(zhì)組織進(jìn)行酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase，TH)免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果：注藥后兩周，動物經(jīng)阿撲嗎啡(APO)誘導(dǎo)即出現(xiàn)向健側(cè)的旋轉(zhuǎn)行為，注射效果穩(wěn)定。在長達(dá)3個月的觀察中，動物的旋轉(zhuǎn)行為穩(wěn)定，無明顯的差異。形態(tài)學(xué)顯示，毀損側(cè)的黑質(zhì)致密部(SNc)和VTA區(qū)的酪氨酸羥化酶(TH)陽性神經(jīng)元的數(shù)

8、量明顯減少。 結(jié)論：行為學(xué)觀察、阿樸嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)觀察到大鼠出現(xiàn)了偏側(cè)的帕金森癥狀，病理學(xué)檢查證實(shí)在大鼠注藥側(cè)黑質(zhì)紋狀體區(qū)有PD特征性改變。通過該方法建立的動物模型較穩(wěn)定，適于進(jìn)行下一步的臨床研究。 第三部分：人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植治療PD大鼠模型目的：通過觀察hRPE細(xì)胞移植治療PD大鼠的行為學(xué)改善及PET影像學(xué)變化，探討hRPE細(xì)胞對PD大鼠的治療效果。 方法：建立PD大鼠模型，隨機(jī)分為治療組和對照組。利

9、用立體定向的技術(shù)將hRPE細(xì)胞以至于治療組的PD大鼠的紋狀體內(nèi)；對照組大鼠紋狀體內(nèi)移植相同劑量的生理鹽水。根據(jù)移植前后大鼠APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為的改善和腦紋狀體TH免疫組化染色改變評估干細(xì)胞移植治療效果。 確定多巴胺D2受體、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DAT)為hRPE細(xì)胞分化細(xì)胞的標(biāo)志物，11C-CFT和11C-raclopride作為相應(yīng)的PET成像放射性示蹤劑。進(jìn)行移植前后的11C-CFT和11C-raclopridePET顯像，觀測

10、D2受體、DAT的變化情況，并運(yùn)用視覺分析和感興趣去方法分析治療組對照組移植前后的顯像變化。 結(jié)果：細(xì)胞移植后，治療組大鼠APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為，由術(shù)前的296±82圈/30分鐘下降至212±102(p=0.0008)；而對照組旋轉(zhuǎn)行為無明顯改善。TH免疫組化染色顯示，移植后治療組的大鼠紋狀體內(nèi)TH陽性細(xì)胞增多、著色較深。而對照組移植前后無明顯變化。 11C-raclopridePET成像顯示模型動物損傷側(cè)D2受體上調(diào)，表

11、現(xiàn)為兩側(cè)不對稱。在移植治療后，治療組大鼠患側(cè)紋狀體放射性濃聚不同程度下降，對照組無變化。 11C-CFTPET成像顯示模型動物損傷側(cè)DAT下降，表現(xiàn)為兩側(cè)不對稱。在移植治療后，治療組大鼠患側(cè)紋狀體放射性濃聚不同程度上調(diào)，對照組無變化。 結(jié)論：hRPE細(xì)胞移植后PD大鼠行為學(xué)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)明顯改善，11C-CFT和11C-raclopridePET成像技術(shù)在體顯示hRPE細(xì)胞分泌多巴胺，具有較好的移植治療效果。 第四

12、部分人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植治療PD的臨床應(yīng)用研究目的：通過觀察PD病人的癥狀改善及PET影像學(xué)變化，探討hRPE細(xì)胞移植對PD的治療的安全性和有效性。。 方法：眼庫來源的hRPE細(xì)胞在體外穩(wěn)定擴(kuò)增，傳代5代后，通過立體定向手術(shù)將其植入PD患者的殼核后部；2005年5月至2006年1月，采用此方法治療PD患者12例，平均年齡66.2歲，平均病程6.9年，術(shù)前術(shù)后按CAPIT要求進(jìn)行評分，并確定多巴胺D2受體、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DA

13、T)為hRPE細(xì)胞分化細(xì)胞的標(biāo)志物，11C-CET和11C-raclopride作為相應(yīng)的PET成像放射性示蹤劑。進(jìn)行移植前后的11C-CFT和11C-raclopridePET顯像，觀測D2受體、DAT的變化情況，并運(yùn)用視覺分析和感興趣去方法分析治療組對照組移植前后的顯像變化。 結(jié)果：本組12例PD臨床立體定向移植手術(shù)經(jīng)過順利，無嚴(yán)重并發(fā)癥、也無明顯免疫排斥反應(yīng)。術(shù)后1個月均出現(xiàn)癥狀改善，PET掃描示移植區(qū)DAT較術(shù)前增加，而