BMSCs移植治療帕金森病細(xì)胞學(xué)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、帕金森病(Parkinsons' disease，PD)是常見于中老年人的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。鑒于PD發(fā)病的主要病理機(jī)制和干細(xì)胞研究的深入，細(xì)胞移植治療有望成為治療該病的理想方法之一，但是細(xì)胞移植治療的機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白(GFP)基因大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)作為示蹤細(xì)胞，探討外源細(xì)胞在治療模型大鼠時(shí)，在腦內(nèi)的存活、遷移及分化情況，并結(jié)合大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)纖維蛋白(GFAP)的表

2、達(dá)變化，探究星形膠質(zhì)細(xì)胞(AST)在治療PD的作用，為研究臨床PD的細(xì)胞移植治療機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)一 轉(zhuǎn)GFP基因大鼠BMSCs作為示蹤細(xì)胞在移植治療帕金森病研究中的應(yīng)用
　　采用立體定位法單側(cè)紋狀體內(nèi)單點(diǎn)注射6-羥多巴胺(6-OHDA)制備PD大鼠模型，術(shù)后以經(jīng)典的阿撲嗎啡(APO)誘導(dǎo)大鼠的轉(zhuǎn)圈數(shù)為指標(biāo)進(jìn)行行為學(xué)檢測，篩選成功PD大鼠模型。取轉(zhuǎn)GFP基因大鼠的BMSCs，將純化的BMSCs定位移植到PD模型大鼠

3、損毀側(cè)紋狀體內(nèi)，移植后2周起用APO誘導(dǎo)大鼠轉(zhuǎn)圈行為，檢測細(xì)胞移植對PD模型大鼠的行為改善情況;在熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)大鼠的腦組織切片，追蹤外源GFP大鼠BMSCs在受體腦內(nèi)的存活、遷移情況;并以免疫組化技術(shù)檢測多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的特異性蛋白——酪氨酸羥化酶(TH)的表達(dá)，研究分化規(guī)律。
　　成功PD大鼠的轉(zhuǎn)圈數(shù)為10.89±1.08 r/min，轉(zhuǎn)GFP基因大鼠的BMSCs移植腦內(nèi)損毀部位后，從第2周開始，旋轉(zhuǎn)圈數(shù)逐漸減少，到第8

4、周降至5.86±1.15 r/min。細(xì)胞移植后，可在紋狀體內(nèi)見到GFP標(biāo)記的外源細(xì)胞，其至少可存活6周;移植后部分細(xì)胞向周圍遷移并有一定的走向，可遷移到大鼠腦內(nèi)廣泛區(qū)域;移植的BMSCs形態(tài)上多數(shù)呈現(xiàn)分化形態(tài)，在移植后6周，熒光免疫組化檢測除見到GFP細(xì)胞的TH陽性表達(dá)，在移植針道周圍還見到大量的內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)TH陽性表達(dá)，即BMSCs在紋狀體內(nèi)能定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并能夠使殘存的多巴胺(DA)能神經(jīng)元功能恢復(fù)。
　　研

5、究結(jié)果顯示BMSCs移植技術(shù)，對改善PD模型大鼠的行為有明顯效果，提示可能機(jī)制是外源BMSCs在腦內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元，部分替代了損毀的多巴胺能神經(jīng)元的功能;移植的外源BMSCs通過產(chǎn)生某些營養(yǎng)因子，有效地恢復(fù)模型動(dòng)物中DA神經(jīng)元的功能或使內(nèi)源性更多的神經(jīng)元樣細(xì)胞特異化為合成多巴胺的細(xì)胞，從而改善PD模型的癥狀。GFP轉(zhuǎn)基因大鼠的BMSCs由于自發(fā)熒光，移植后方便觀察外源細(xì)胞在受體腦內(nèi)的存活、遷移和分化規(guī)律，是細(xì)胞移植研究中具有

6、廣泛運(yùn)用前景的示蹤細(xì)胞。
　　實(shí)驗(yàn)二 移植BMSCs對帕金森病模型大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)的影響
　　本研究通過檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)，探究腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞(AST)在BMSCs移植治療PD中的功能。實(shí)驗(yàn)分別提取正常大鼠、PD模型大鼠和BMSCs移植治療4周及8周大鼠腦的總RNA和蛋白，再以熒光定量PCR和western blot方法測定腦內(nèi)GFAP的mRNA及蛋白的含量，對比分析模型及治療前后mRN

7、A表達(dá)水平的變化與蛋白表達(dá)水平變化的聯(lián)系，同時(shí)結(jié)合酪氨酸羥化酶(TH)的蛋白表達(dá)水平及熒光免疫組化檢測大鼠腦組織內(nèi)TH的表達(dá)變化，從而直觀地了解大鼠腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的變化與AST的關(guān)系。
　　結(jié)果顯示，模型大鼠損毀側(cè)腦紋狀體內(nèi)GFAP mRNA的表達(dá)水平是正常大鼠的1.33倍，GFAP蛋白表達(dá)也高于正常鼠，但是TH蛋白含量明顯減少;BMSCs移植治療后，腦內(nèi)GFAP mRNA的表達(dá)逐漸減少，術(shù)后4周的大鼠原損毀側(cè)腦的表達(dá)量是對照

8、模型鼠的0.63倍，GFAP蛋白卻增加，TH蛋白表達(dá)也增加;術(shù)后8周大鼠原損毀側(cè)腦GFAP mRNA的表達(dá)是對照模型鼠的0.30倍，GFAP蛋白亦減少，TH蛋白表達(dá)增加，最后均接近于正常大鼠腦內(nèi)蛋白的表達(dá)。熒光免疫組化法，可見外源細(xì)胞周圍TH含量明顯增多，代替多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)元樣細(xì)胞也較模型大鼠增多。
　　BMSCs移植治療PD大鼠模型的過程中，正常動(dòng)物腦內(nèi)GFAP免疫組化表達(dá)陰性，但在制備PD模型的過程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，

9、并出現(xiàn)GFAP的增強(qiáng)表達(dá)，成為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，而損傷修復(fù)后GFAP的表達(dá)又呈陰性。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的獨(dú)有標(biāo)志，因此，研究星形膠質(zhì)細(xì)胞在治療帕金森大鼠模型研究中的變化對探究帕金森治療機(jī)制有重要意義。作為支撐性細(xì)胞，能準(zhǔn)確引導(dǎo)神經(jīng)元遷移到腦內(nèi)損傷部位，并且分泌出大量的營養(yǎng)因子，促進(jìn)DA神經(jīng)元的生成而修復(fù)黑質(zhì)-紋狀體DA神經(jīng)通路，其中最為重要的營養(yǎng)因子GFAP，對脊椎動(dòng)物有強(qiáng)烈的保護(hù)作用，并且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中行使重要功