復(fù)制缺陷型腺病毒介導(dǎo)糖調(diào)節(jié)蛋白GRP94表達(dá)應(yīng)用于腫瘤免疫基因治療.pdf

1、研究背景： 腫瘤細(xì)胞群為克隆性生長(zhǎng)，包含大量的基因突變，因而每一種腫瘤均有其獨(dú)特的抗原肽，具有潛在的引起腫瘤免疫反應(yīng)的功能。一般情況下腫瘤細(xì)胞并不能引起足夠的免疫反應(yīng)，其中很重要的一個(gè)原因是因?yàn)榭乖f呈細(xì)胞功能不足或不適。因此提高腫瘤抗原的遞呈能力，有可能引起有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。 糖調(diào)節(jié)蛋白94(GRP94)是熱休克蛋白HSP90家族的一員，位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其功能與蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的折疊與裝配密切相關(guān)。在細(xì)胞經(jīng)受壓力的

2、情況下(如熱壓力，糖缺乏等)，GRP94表達(dá)顯著升高，結(jié)合并保護(hù)細(xì)胞蛋白不被降解，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能有非常重要的作用。 近年來(lái)，由于GRP94可能在腫瘤免疫治療中有重要作用而受到廣泛注意。研究顯示，在小鼠腫瘤模型中，腫瘤組織來(lái)源的GRP94可以刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)—它既能刺激天然免疫反應(yīng)，也可引起適應(yīng)性免疫反應(yīng)。對(duì)其深入研究可能為腫瘤免疫治療開(kāi)辟一片新天地。目前國(guó)外有研究從腫瘤組織提取GRP94蛋白，以此作疫苗回注體內(nèi)，對(duì)腫瘤進(jìn)行

3、治療取得了一定的效果。但此方案有一定的局限性，如純化過(guò)程對(duì)腫瘤抗原肽的丟失；蛋白的提取量受腫瘤大小的限制；針對(duì)每種腫瘤提取HSP，費(fèi)用昂貴，不易建立標(biāo)準(zhǔn)化的方案等。 腺病毒作為基因治療的載體近10年來(lái)已有廣泛應(yīng)用。腺病毒能感染大部分類型的腫瘤細(xì)胞，將自身基因轉(zhuǎn)移到被感染細(xì)胞的胞核中，在感染細(xì)胞中能高效表達(dá)攜帶基因。對(duì)腺病毒結(jié)構(gòu)已有較透徹的了解，因而有可能對(duì)其進(jìn)行基因改造，包裝出適合不同目的的病毒，如復(fù)制缺陷型腺病毒，并可在其多基

4、因克隆位點(diǎn)插入所需的目的基因。此外，已有很成熟的方法大量提取獲得高滴度的病毒，而不會(huì)影響其對(duì)細(xì)胞的感染能力。由于這些優(yōu)點(diǎn)，腺病毒被作為重要的向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)外NNN的載體。本研究用復(fù)制缺陷型腺病毒介導(dǎo)GRP94表達(dá)，探討其在腫瘤免疫基因治療中的應(yīng)用。 方法：采用帶GRP94分泌型蛋白質(zhì)基因的復(fù)制缺陷型腺病毒，在一生長(zhǎng)迅速，免疫原性弱，而轉(zhuǎn)移性極強(qiáng)的小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞模型中，表達(dá)GRP94；通過(guò)一系列免疫實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)GRP94

5、對(duì)機(jī)體抗腫瘤免疫功能的影響；進(jìn)一步將其與放射治療相結(jié)合，探討其對(duì)已建立的腫瘤模型的治療作用以及對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的控制作用。 結(jié)果：1)復(fù)制缺陷型腺病毒AdsGRP94GFP對(duì)4T1腫瘤細(xì)胞的感染效率高，當(dāng)AdsGRP94GFP濃度為40MOI時(shí)，對(duì)4T1腫瘤細(xì)胞的感染率可達(dá)到94％。2)AdsGRP94GFP介導(dǎo)的GRP94蛋白能分泌到細(xì)胞外，并且這種分泌不會(huì)受到放射線照射的影響，經(jīng)致死劑量放射線照射后，仍能穩(wěn)定分泌GRP94蛋白6天

6、以上。3)用AdsGRP94GFP病毒感染的4T1細(xì)胞接種BALB／c小鼠，能引起淋巴細(xì)胞在腫瘤組織的大量聚集，腫瘤的生長(zhǎng)明顯滯后于對(duì)照組，在其中兩例中腫瘤被完全排斥。4)用表達(dá)GRP94蛋白的4T1腫瘤細(xì)胞對(duì)BALB／c小鼠進(jìn)行預(yù)防性免疫，可以完全抑制再次接種多達(dá)1×10<'7>腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。其脾細(xì)胞對(duì)4T1細(xì)胞的特異性裂解顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，脾細(xì)胞干擾素IFN-Y的分泌顯著高于對(duì)照組。5)用AdsGRP94GFP感染的

7、4T1細(xì)胞進(jìn)行腹腔免疫，同時(shí)在腫瘤瘤體內(nèi)注射病毒，并與放射治療結(jié)合，能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，提高小鼠的生存率。其中2只(20％)小鼠完全治愈，無(wú)瘤存活1年以上。6)腹腔內(nèi)注射AdsGRP94GFP感染的4T1細(xì)胞能明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，其作用獨(dú)立于放射治療。而在瘤體內(nèi)注射AdsGRP94GFP病毒，如不與放療結(jié)合，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)影響與對(duì)照組無(wú)區(qū)別，與放療結(jié)合時(shí)，則可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。7)GRP94．治療能顯著增強(qiáng)放療治療的效果，GRP94治療聯(lián)合