重組復(fù)制缺陷型腺病毒介導(dǎo)的人IL-24-MDA-7基因治療胰腺癌的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1．構(gòu)建攜帶IL—24基因片段的重組復(fù)制缺陷型腺病毒Ad—IL—24，為探討治療胰腺癌的方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2．觀察重組腺病毒介導(dǎo)的IL—24基因?qū)θ艘认侔┘?xì)胞patu8988生長的抑制作用，探討IL—24抑制胰腺腫瘤生長的機(jī)理。 3．研究重組腺病毒介導(dǎo)的IL—24基因?qū)π∈笏柘禈渫粻罴?xì)胞成熟活化的影響，探討IL—24基因在腫瘤免疫治療中的作用。 4．觀察重組腺病毒介導(dǎo)的IL—24基因?qū)β闶篌w內(nèi)胰

2、腺腫瘤生長的抑制作用，探討IL—24對(duì)胰腺癌的治療潛力。 方法：從Genbank中查得IL—24基因cDNA全長序列，選擇5’端轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近長621bp的基因序列為目的基因片段，設(shè)計(jì)特異性克隆引物。從人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中提取總RNA，以總RNA為模板用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription—polymerase chain reaction，RT—PCR）擴(kuò)增IL—24基因片段。將經(jīng)基因測

3、序證實(shí)為正確的基因片段反向克隆到重組腺病毒載體AdEasy系統(tǒng)中的穿梭質(zhì)粒pAdTrack—CMV的多克隆位點(diǎn)（multiple cloning site，MCS），構(gòu)建攜帶IL—24基因片段的重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack—CMV—IL—24；再將pAdTrack—CMV—IL—24與重組腺病毒載體AdEasy系統(tǒng)中的骨架質(zhì)粒pAdEasy—1在大腸桿菌DH5a內(nèi)進(jìn)行同源重組，經(jīng)293細(xì)胞包裝生成攜帶IL—24基因片段的重組腺病毒Ad—

4、IL—24，同時(shí)構(gòu)建空病毒Ad—GFP。通過在熒光顯微鏡下觀察發(fā)綠色熒光數(shù)檢測綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的表達(dá)，測定Ad—IL—24和Ad—GFP的滴度。用感染復(fù)數(shù)（multiplicities of infection，MOI）為100的Ad—IL—24感染人胰腺癌細(xì)胞株patu8988，用Western blot、ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL—24的蛋白表達(dá)；用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)

5、（FCM）分別檢測Ad—IL—24對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株patu8988生長情況的影響。采用小鼠髓系樹突狀細(xì)胞（BMDCs）開展研究，從小鼠骨髓中獲取和培養(yǎng)未成熟樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC），通過FCM、ELISA法檢測DC經(jīng)IL—24轉(zhuǎn)染后表型和功能狀態(tài)的變化，研究IL—24促進(jìn)DC成熟活化的作用。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察人胰腺癌patu8988細(xì)胞的成瘤情況及IL—24對(duì)裸鼠體內(nèi)胰腺腫瘤的治療作用；通過免疫組化檢測腫瘤組織

6、中微血管密度MVD、VEGF、MMP—2的表達(dá)。 結(jié)果： 1．成功的從人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中提取并擴(kuò)增出621bp的IL—24基因片段，經(jīng)DNA測序證實(shí)該基因片段序列與Genbank中IL—24基因cDNA序列5’端轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近621bp的基因序列完全一致。 2．成功地構(gòu)建出攜帶IL—24基因片段的重組腺病毒Ad—IL—24，病毒滴度>5×1010pfu/ml。 3．Ad—IL—24感染的p

7、atu8988細(xì)胞增殖能力降低，凋亡率明顯升高。 4．IL—24刺激BMDCs48h后，細(xì)胞表現(xiàn)出成熟DCs的表型和功能特征，即共刺激分子CD40，CD80，CD86上調(diào)表達(dá)；并能有效拮抗負(fù)性調(diào)控因子IL—10下調(diào)DCs上CD40、CD80、CD86表達(dá)的作用，細(xì)胞培養(yǎng)液中IL—12、TNF—α的表達(dá)水平升高。 5．瘤內(nèi)注射Ad—IL—24后胰腺腫瘤瘤體生長減慢，腫瘤內(nèi)微血管密度MVD、VEGF、MMP—2較對(duì)照組明顯減