小鼠真菌性角膜炎模型中主要炎性因子表達(dá)的研究.pdf

1、目的：探索建立一種理想的模擬臨床人角膜真菌感染的小鼠真菌性角膜炎模型并對(duì)其角膜組織損傷的臨床表現(xiàn)和組織病理學(xué)改變進(jìn)行全面觀察;同時(shí)在此基礎(chǔ)上利用分子生物學(xué)技術(shù),對(duì)真菌性角膜炎炎癥發(fā)生過(guò)程中作為核心環(huán)節(jié)的主要炎性因子的表達(dá)、作用及調(diào)控進(jìn)行研究,以促進(jìn)對(duì)真菌性角膜炎發(fā)病機(jī)制的研究和發(fā)展更為有效的真菌性角膜炎治療手段. 方法： 1、動(dòng)物模型創(chuàng)建選取茄病鐮刀菌、煙曲霉菌和白色念珠菌等三種主要角膜致病真菌標(biāo)準(zhǔn)菌株以及健康6～8

2、周齡近交系BALB/c小鼠,采用"角膜表面鏡片術(shù)輔助上皮刮除法"建立角膜真菌感染模型,接種菌液濃度為1×106CFU/ml,感染術(shù)后縫合小鼠瞼裂,24 h后打開(kāi)眼瞼,每天于裂隙燈顯微鏡下觀察角膜感染情況,數(shù)碼相機(jī)照相記錄,分別于感染后1、3、5、7和12 d采用半定量方法對(duì)感染角膜予以臨床評(píng)分,并在感染后不同時(shí)間點(diǎn)取小鼠實(shí)驗(yàn)眼角膜刮片物進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè). 2、組織病理學(xué)檢測(cè)分別于感染后1、3、5、7和12 d摘取各實(shí)驗(yàn)組小鼠眼球

3、,均置于10﹪福爾馬林快速固定液中固定24 h,常規(guī)制作石蠟切片,并分別行蘇木素-伊紅㈣染色和過(guò)碘酸Schiff(PAS)染色,光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行分析.觀察項(xiàng)目包括炎癥反應(yīng)、真菌負(fù)荷和真菌菌絲的生長(zhǎng)方式,其中對(duì)炎癥反應(yīng)和真菌負(fù)荷程度采用半定量方法分為輕、中、重三級(jí)并予以評(píng)分.對(duì)菌絲在角膜中的生長(zhǎng)方式,以真菌菌絲走行方向與角膜板層成角大小作為判斷標(biāo)準(zhǔn),成角大于45度者被判定為垂直生長(zhǎng),小于45度者為水平生長(zhǎng). 3、主要炎性因子表達(dá)

4、的研究分別于感染后1、3、5、7和12 d取各感染組小鼠實(shí)驗(yàn)眼病變角膜,采用RT-PCR和ELISA技術(shù)對(duì)不同菌種感染角膜組織中的巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2(MIP-2)、細(xì)胞因子誘生性中性粒細(xì)胞趨化物(KC)、白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)等4種炎性因子的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),RT-PCR結(jié)果采用Image J計(jì)算機(jī)圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析.4、炎性因子特異性多克隆抗體干預(yù)實(shí)驗(yàn)選取健康6～8周齡近交系BALB/c

5、小鼠,分為3大組,每大組再分為3個(gè)小組,分別接種三種主要角膜致病真菌.第1大組為感染對(duì)照組,于術(shù)前1 h和術(shù)后24 h對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)眼分別給予20μl滅菌生理鹽水結(jié)膜下注射,第2大組給予MIP-2多克隆抗體20μl(2ng/μl)、第3大組則給予IL-1β多克隆抗體20μl(2ng/μl)結(jié)膜下注射,采用"角膜表面鏡片術(shù)輔助上皮刮除法"建立小鼠角膜真菌感染模型,接種菌液濃度為1×10<'6>CFU/ml.感染24 h拆除眼瞼縫線后每天用裂隙

6、燈顯微鏡觀察動(dòng)物角膜感染情況并予以臨床評(píng)分,并分別于感染后1、3、5、7和12 d摘取各組小鼠眼球制成常規(guī)石蠟切片,HE和PAS染色觀察病變組織炎癥反應(yīng)、真菌負(fù)荷和真菌菌絲的生長(zhǎng)方式.此外,分別于感染后1、3、5、7和12 d摘取第2和第3大組各小組小鼠實(shí)驗(yàn)眼角膜,采用ELISA法對(duì)其MIP-2和KC的蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè). 結(jié)論： 1、利用"角膜表面鏡片術(shù)輔助上皮刮除法"可成功建立穩(wěn)定、可靠的模擬臨床人角膜病變的

7、小鼠真菌性角膜炎模型,為進(jìn)一步研究真菌性角膜炎的發(fā)病機(jī)制等奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ). 2、真菌性角膜炎病變過(guò)程可區(qū)分為早、中、晚期三個(gè)階段,分別表現(xiàn)為病變的浸潤(rùn)擴(kuò)展、化膿壞死和瘢痕愈復(fù)等主要特征,但不同菌種導(dǎo)致的病變嚴(yán)重程度各有差異,炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致真菌性角膜炎病變損害的主要因素,這為真菌性角膜炎的基礎(chǔ)和臨床研究指出了一個(gè)新的方向.. 3、不同角膜致病真菌菌種在角膜中表現(xiàn)出有不同的生長(zhǎng)方式,這一現(xiàn)象對(duì)臨床上真菌性角膜炎患者采取

8、手術(shù)治療時(shí)手術(shù)方式和時(shí)機(jī)的選擇具有一定的參考價(jià)值. 4、小鼠真菌性角膜炎角膜病變組織中均有MIP-2、KC、IL-1β和lL6等趨化因子和細(xì)胞因子的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá).其中MIP-2是小鼠真菌性角膜炎發(fā)病中關(guān)鍵的趨化因子,IL-1B則是最重要的細(xì)胞因子并對(duì)MIP-2和KC的表達(dá)有調(diào)控作用,MIP-2和IL-β的持續(xù)高水平表達(dá)在角膜病變損害中起著重要甚至是主要的作用,而IL-6的表達(dá)是小鼠真菌性角膜炎中機(jī)體重要的防御和保護(hù)性