IDO在真菌性角膜炎真菌免疫耐受中的作用及調(diào)控機制的研究.pdf

1、目的：探討吲哚胺2，3雙加氧酶（Indoleamine2,3-dioxygenase，IDO）在真菌性角膜炎中的表達、介導真菌性角膜炎真菌免疫耐受的功能以及相關(guān)的模式識別受體對其調(diào)控的機制。
　　方法：分別在真菌性角膜炎患者、體外培養(yǎng)的人角膜上皮細胞真菌感染的細胞模型以及真菌性角膜炎小鼠動物模型上研究了IDO的表達規(guī)律、IDO介導真菌性角膜炎中真菌免疫耐受的功能及相關(guān)的模式識別受體對IDO及下游炎癥因子的調(diào)控機制。據(jù)此，實驗從三個

2、方面加以證實：⑴選擇2012年1月至2014年12月在青島大學附屬醫(yī)院眼科就診的真菌性角膜炎初診患者31例（31眼）為真菌感染組，根據(jù)角膜潰瘍的嚴重程度及裂隙燈下的炎癥評分分為輕、中、重度感染三組，收集角膜病灶周圍的角膜上皮組織；同時收集角膜移植中健康供體制作角膜植片后剩余的周邊角膜緣組織6例（6眼）為正常對照組，刮取植片的角膜上皮組織。免疫熒光法檢測臨床真菌性角膜炎患者角膜組織中IDO的表達與定位，qRT-PCR法檢測正常對照組和真菌

3、性角膜感染組中IDO的表達差異及其與真菌性角膜炎感染嚴重程度之間的關(guān)系。建立C57BL/6小鼠真菌性角膜炎感染模型，免疫組織化學染色、qRT-PCR法、Western blot法進一步明確真菌性角膜炎角膜組織中IDO的表達規(guī)律。⑵體外培養(yǎng)人永生化角膜上皮細胞，加入煙曲霉菌孢子刺激液，qRT-PCR檢測不同作用濃度及時間點角膜上皮細胞中IDO的表達，篩選作用顯著的刺激液；qRT-PCR及ELISA檢測1-MT（IDO特異性的抑制劑）預處理

4、后煙曲霉菌刺激液誘導的角膜上皮細胞IDO表達的改變以及對IDO下游炎癥因子分泌的影響。將健康的C57BL/6小鼠隨機分為對照組（給予PBS飲水預處理，刮取直徑約2mm的中央角膜上皮，覆蓋角膜接觸鏡）、煙曲霉菌感染組（刮取直徑約2mm的中央角膜上皮后接種真菌，覆蓋角膜接觸鏡）和1-MT預處理+煙曲霉菌感染組（IDO的抑制劑1-MT飲水預處理后，刮取中央角膜上皮后接種真菌，再覆蓋角膜接觸鏡），根據(jù)感染的嚴重程度進行炎癥評分，收集小鼠的角膜行

5、qRT-PCR、免疫熒光和流式細胞術(shù)，比較IDO阻斷前后角膜的感染嚴重程度的評分，檢測IDO的表達、定位及其對IDO下游的炎癥因子表達的影響，觀察IDO阻斷前后角膜、淋巴結(jié)及脾臟組織中Th17和Treg細胞含量之間的變化，從而分析IDO介導真菌免疫耐受的相關(guān)機制。⑶體外培養(yǎng)人的角膜上皮細胞，給予不同的模式識別受體Dectin-1、TLR2、TLR4的特異性配體，qRT-PCR篩選角膜上皮細胞中調(diào)控IDO表達的模式識別受體；分別給予1-M

6、T，Dectin-1的激動和抑制劑預處理，在煙曲霉菌孢子誘導的人角膜上皮細胞的IDO誘導模型上，應用qRT-PCR、ELISA和Western blot檢測Dectin-1對IDO及其下游炎癥因子的調(diào)控。
　　結(jié)果：①對臨床真菌性角膜炎患者的病變角膜組織行免疫熒光染色在蛋白水平證實IDO在正常的角膜上皮組織中無或極少量的表達，而在煙曲霉菌性角膜炎患者角膜組織中IDO的表達明顯增加并主要表達于角膜上皮組織中；在臨床真菌性角膜炎患者的

7、角膜上皮組織中，qRT-PCR檢測顯示：與正常對照組相比，真菌性角膜炎患者的角膜上皮組織中的IDO mRNA表達明顯增加，并且隨著感染及炎癥程度的增加，IDO的表達升高越明顯，輕、中、重度各組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；C57BL/6小鼠真菌性角膜炎感染的模型中 qRT-PCR結(jié)果顯示真菌感染后 IDO mRNA表達明顯增高，1d達到高峰，之后開始降低。Western blot結(jié)果顯示IDO的蛋白水平在真菌感染后1d開始增加，

8、3d達高峰。②在體外培養(yǎng)的人角膜上皮細胞中，滅活的煙曲霉菌孢子可以誘導上皮細胞中IDO的表達量增加，并呈現(xiàn)出濃度依賴的變化趨勢。qRT-PCR結(jié)果顯示：與煙曲霉菌孢子刺激組相比，1-MT預處理組角膜上皮細胞中IDO及下游通路因子IL-1β、IL-6表達增加，ELISA檢測在蛋白水平證實了相關(guān)的炎癥因子的變化；在C57BL/6小鼠和1-MT預處理鼠的煙曲霉菌感染模型中，疾病評分顯示1-MT預處理模型鼠組的感染程度明顯重于單純的煙曲霉菌感染

9、組，qRT-PCR、ELISA顯示：與AF組相比，AF+1-MT組鼠角膜中IDO及IDO下游通路因子IL-1β、IL-6表達明顯增加。qRT-PCR結(jié)果顯示Th17型細胞因子（IL-17、IL-23）表達增加，Treg型細胞因子（IL-10、TGF-β）表達減少。流式細胞術(shù)的檢查結(jié)果顯示，與 AF組相比，IDO阻斷后小鼠真菌感染動物模型中角膜及脾臟組織中Th17細胞含量增加，Treg細胞含量減少，Th17/Treg細胞含量比增加，差異具

10、有統(tǒng)計學意義。③采用不同的模式識別受體Dectin-1、TLR2、TLR4的特異性配體即Curdlan、Pam3csk4、LPS作用于角膜上皮細胞后，qRT-PCR檢測顯示TLR2、TLR4的特異性配體不能誘導IDO的表達，而真菌感染組和Dectin-1特異性的配體Curdlan組均能明顯地誘導IDO的表達。給予Dectin-1的激動劑和抑制劑能夠調(diào)控煙曲霉菌對IDO的刺激作用，Western blot檢測在蛋白水平證實了這一變化。