蛋白激酶C、堿性成纖維細胞生長因子在吸煙促進肺動脈平滑肌細胞增殖中作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　 吸煙不僅可引起慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺氣腫，而且還可進一步導(dǎo)致肺動脈高壓和慢性肺源性心臟病。肺動脈高壓與慢性阻塞性肺病(COPD)患者的臨床預(yù)后惡化、生存率降低密切相關(guān)，目前尚缺乏特異而有效的治療。既往對COPD合并肺動脈高壓發(fā)病機制的研究多集中于缺氧性肺血管收縮和缺氧性肺血管重建。近年發(fā)現(xiàn)吸煙可直接導(dǎo)致肺血管重建、參與肺動脈高壓的形成，其主要機制可能是吸煙促進肺動脈平滑肌細胞(PASMC)的增殖，但具體機制

2、尚不清楚。細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活、生長因子的產(chǎn)生和釋放在吸煙致PASMC增殖中可能起著重要作用。
　　 蛋白激酶C(PKC)是細胞內(nèi)生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一類關(guān)鍵酶，參與調(diào)控血管平滑肌細胞的增殖、凋亡、分化、遷移和基因表達等。我們實驗室以往的研究發(fā)現(xiàn)PKC的活化，PKC a亞型的表達上調(diào)在低氧致PASMC增殖中起重要作用。前期研究工作還發(fā)現(xiàn)無論是慢性吸煙大鼠，還是吸煙非COPD患者和吸煙COPD患者其肺小動脈PKC-a mRNA

3、及蛋白質(zhì)的表達都增加，提示PKC-a可能參與了慢性吸煙所致的肺血管重建。但PKC特別是PKC-a在吸煙對PASMC增殖的影響中所起的作用有待在細胞培養(yǎng)水平進一步予以研究。
　　 堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)作為一種生長因子和絲裂原，可促進肺動脈內(nèi)皮細胞增殖，外膜成纖維細胞生長，強烈地刺激中膜平滑肌細胞增殖、遷移、合成分泌膠原和纖維連接蛋白等細胞外基質(zhì)，在低氧和野百合堿所致的肺血管重建和肺動脈高壓中發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)

4、，在吸煙合并COPD的患者中，bFGF在肺小動脈平滑肌細胞的表達增加，可能參與了吸煙所致的肺血管重建，但目前尚無相關(guān)的動物在體實驗和離體實驗的研究。
　　 本研究從PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和bFGF兩個方面探討吸煙致PASMC增生和肺血管重建的可能機制，為COPD合并肺動脈高壓的發(fā)病機制研究和防治提供基礎(chǔ)資料。
　　 第一部分
　　 目的：探討香煙煙霧提取物(CSE)對體外培養(yǎng)的大鼠和人PASMC增殖的影響及PKC信號

5、轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在其中所起的作用。
　　 方法：組織塊法培養(yǎng)正常Wistar大鼠PASMC，復(fù)蘇培養(yǎng)人PASMC細胞系。(1)不同濃度的CSE作用于PASMC 24h，四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測PASMC增殖，臺盼藍排斥法檢測活細胞率。(2)PASMC與PKC激活劑12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯(PMA)預(yù)孵育24h下調(diào)PKC或與PKC抑制劑馬來酰亞胺甲磺酸鹽(Ro31-8220)預(yù)孵育30min然后暴露于5[％]CSE，MT

6、T法、流式細胞術(shù)和增殖細胞核抗原(PCNA)染色等方法觀察細胞增殖的變化。(3)5[％]CSE作用PASMC 24h，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western Blot分別檢測PKC-a mRNA和蛋白質(zhì)表達量的變化。免疫熒光細胞化學(xué)及激光共聚焦掃描檢測大鼠PASMC內(nèi)PKC-a的分布。(4)大鼠PASMC暴露于5[％]CSE前6h轉(zhuǎn)染PKC-a的反義寡核苷酸，觀察PKC-a蛋白表達量和細胞增殖的變化。
　　 結(jié)果：

7、(1)20[％]和30[％]CSE對PASMC有細胞毒性作用，5[％]和10[％]CSE不影響PASMC的活細胞率。5[％]CSE組PASMC MTT的吸光度(A)值較對照組明顯增高。(2)5[％]CSE組PASMC的MTT A值、增殖指數(shù)(PI)、S期細胞分數(shù)(SPF)和PCNA染色平均光密度值增高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PMA+5[％]CSE組和Ro+5[％]CSE組以上指標均降低，與5[％]CSE組比較，差

8、異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與對照組比較，差異無顯著性。(3)5[％]CSE組PKC-a mRNA和蛋白表達量增加，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。5[％]CSE處理后，大鼠PASMC中PKC-a由細胞漿轉(zhuǎn)位至細胞核周或核內(nèi)。(4)PKC-a反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染組大鼠PASMC中PKC-a蛋白質(zhì)表達量降低(轉(zhuǎn)染前后分別為1.180±0.056、0.713±0.047)，MTT A值降低(0.252±0.041)，與5[％

9、]CSE組(0.302±0.021)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與對照組(0.244±0.016)比較，差異無顯著性。
　　 結(jié)論：高濃度的CSE對大鼠和人PASMC有細胞毒性作用，低濃度(5[％])的CSE則能促進大鼠和人PASMC的增殖。PKC特別是PKC-a在CSE促PASMC增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制中起重要作用。
　　 第二部分
　　 分題1
　　 目的：探討煙霧暴露對大鼠肺動脈bFGF表達

10、的影響及這種影響與肺血管重建的關(guān)系。
　　 方法：健康雄性Wistar大鼠30只，隨機分為正常對照組(C組)、煙霧暴露組(S2w組、S4w組、S8w組、S12w組)。取動脈血檢測血氧分壓(PaO2)，右心導(dǎo)管法測定平均肺動脈壓(mPAP)。A平滑肌肌動蛋白(a-SM-actin)染色顯示肺血管的重建，PCNA染色檢測細胞增殖。RT-PCR檢測肺動脈bFGF mRNA表達，免疫組織化學(xué)染色檢測bFGF蛋白表達。
　　 結(jié)果

11、：與C組大鼠比較，煙霧暴露各組大鼠PaO2和mPAP無明顯改變。S4w組、S8w組和S12w組大鼠肺泡管旁肺小動脈肌化比例和煙霧暴露各組大鼠肺小血管壁細胞的增殖指數(shù)明顯高于C組(P<0.05)。煙霧暴露各組大鼠肺動脈bFGF mRNA[(0.327±0.076)、(0.483±0.131)、(0.828±0.207)、(0.743±0.159)]和蛋白的表達[(0.184±0.012)、(0.230±0.017)、(0.292±0.01

12、3)、(0.325±0.020)]均較C組明顯增強(P<0.05)。大鼠肺小動脈肌化比例、肺小血管壁細胞的增殖指數(shù)與bFGF mRNA和蛋白表達水平成顯著正相關(guān)。
　　 結(jié)論：煙霧暴露能誘導(dǎo)肺小血管壁細胞增殖，導(dǎo)致肺血管重建，其程度隨暴露時間延長而加重，bFGF在此過程中可能起重要作用。
　　 分題2
　　 目的：研究CSE對大鼠PASMC中bFGF表達的影響及PKC途徑在其中所起的作用。
　　 方法：組

13、織塊法培養(yǎng)正常Wistar大鼠PASMC。5[％]CSE作用于PASMC不同時間或PASMC先與PKC特異性抑制劑Ro31-8220預(yù)孵育，然后再暴露于5[％]CSE，RT-PCR檢測PASMC bFGF mRNA表達，免疫細胞化學(xué)檢測bFGF蛋白表達。
　　 結(jié)果：對照組PASMC中有少量bFGF mRNA和蛋白表達(分別為0.093±0.034，0.142±0.013)。暴露于5[％]CSE后4h細胞內(nèi)bFGF mRNA和蛋