蛋白激酶C、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在吸煙促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　 吸煙不僅可引起慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺氣腫，而且還可進(jìn)一步導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓和慢性肺源性心臟病。肺動(dòng)脈高壓與慢性阻塞性肺病(COPD)患者的臨床預(yù)后惡化、生存率降低密切相關(guān)，目前尚缺乏特異而有效的治療。既往對(duì)COPD合并肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制的研究多集中于缺氧性肺血管收縮和缺氧性肺血管重建。近年發(fā)現(xiàn)吸煙可直接導(dǎo)致肺血管重建、參與肺動(dòng)脈高壓的形成，其主要機(jī)制可能是吸煙促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)的增殖，但具體機(jī)制

2、尚不清楚。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活、生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生和釋放在吸煙致PASMC增殖中可能起著重要作用。
　　 蛋白激酶C(PKC)是細(xì)胞內(nèi)生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一類關(guān)鍵酶，參與調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、遷移和基因表達(dá)等。我們實(shí)驗(yàn)室以往的研究發(fā)現(xiàn)PKC的活化，PKC a亞型的表達(dá)上調(diào)在低氧致PASMC增殖中起重要作用。前期研究工作還發(fā)現(xiàn)無(wú)論是慢性吸煙大鼠，還是吸煙非COPD患者和吸煙COPD患者其肺小動(dòng)脈PKC-a mRNA

3、及蛋白質(zhì)的表達(dá)都增加，提示PKC-a可能參與了慢性吸煙所致的肺血管重建。但PKC特別是PKC-a在吸煙對(duì)PASMC增殖的影響中所起的作用有待在細(xì)胞培養(yǎng)水平進(jìn)一步予以研究。
　　 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)作為一種生長(zhǎng)因子和絲裂原，可促進(jìn)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，外膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，強(qiáng)烈地刺激中膜平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、合成分泌膠原和纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，在低氧和野百合堿所致的肺血管重建和肺動(dòng)脈高壓中發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)

4、，在吸煙合并COPD的患者中，bFGF在肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的表達(dá)增加，可能參與了吸煙所致的肺血管重建，但目前尚無(wú)相關(guān)的動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)和離體實(shí)驗(yàn)的研究。
　　 本研究從PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和bFGF兩個(gè)方面探討吸煙致PASMC增生和肺血管重建的可能機(jī)制，為COPD合并肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制研究和防治提供基礎(chǔ)資料。
　　 第一部分
　　 目的：探討香煙煙霧提取物(CSE)對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠和人PASMC增殖的影響及PKC信號(hào)

5、轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在其中所起的作用。
　　 方法：組織塊法培養(yǎng)正常Wistar大鼠PASMC，復(fù)蘇培養(yǎng)人PASMC細(xì)胞系。(1)不同濃度的CSE作用于PASMC 24h，四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)PASMC增殖，臺(tái)盼藍(lán)排斥法檢測(cè)活細(xì)胞率。(2)PASMC與PKC激活劑12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯(PMA)預(yù)孵育24h下調(diào)PKC或與PKC抑制劑馬來(lái)酰亞胺甲磺酸鹽(Ro31-8220)預(yù)孵育30min然后暴露于5[％]CSE，MT

6、T法、流式細(xì)胞術(shù)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)染色等方法觀察細(xì)胞增殖的變化。(3)5[％]CSE作用PASMC 24h，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western Blot分別檢測(cè)PKC-a mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)及激光共聚焦掃描檢測(cè)大鼠PASMC內(nèi)PKC-a的分布。(4)大鼠PASMC暴露于5[％]CSE前6h轉(zhuǎn)染PKC-a的反義寡核苷酸，觀察PKC-a蛋白表達(dá)量和細(xì)胞增殖的變化。
　　 結(jié)果：

7、(1)20[％]和30[％]CSE對(duì)PASMC有細(xì)胞毒性作用，5[％]和10[％]CSE不影響PASMC的活細(xì)胞率。5[％]CSE組PASMC MTT的吸光度(A)值較對(duì)照組明顯增高。(2)5[％]CSE組PASMC的MTT A值、增殖指數(shù)(PI)、S期細(xì)胞分?jǐn)?shù)(SPF)和PCNA染色平均光密度值增高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PMA+5[％]CSE組和Ro+5[％]CSE組以上指標(biāo)均降低，與5[％]CSE組比較，差

8、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性。(3)5[％]CSE組PKC-a mRNA和蛋白表達(dá)量增加，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。5[％]CSE處理后，大鼠PASMC中PKC-a由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核周或核內(nèi)。(4)PKC-a反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染組大鼠PASMC中PKC-a蛋白質(zhì)表達(dá)量降低(轉(zhuǎn)染前后分別為1.180±0.056、0.713±0.047)，MTT A值降低(0.252±0.041)，與5[％

9、]CSE組(0.302±0.021)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與對(duì)照組(0.244±0.016)比較，差異無(wú)顯著性。
　　 結(jié)論：高濃度的CSE對(duì)大鼠和人PASMC有細(xì)胞毒性作用，低濃度(5[％])的CSE則能促進(jìn)大鼠和人PASMC的增殖。PKC特別是PKC-a在CSE促PASMC增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中起重要作用。
　　 第二部分
　　 分題1
　　 目的：探討煙霧暴露對(duì)大鼠肺動(dòng)脈bFGF表達(dá)

10、的影響及這種影響與肺血管重建的關(guān)系。
　　 方法：健康雄性Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(C組)、煙霧暴露組(S2w組、S4w組、S8w組、S12w組)。取動(dòng)脈血檢測(cè)血氧分壓(PaO2)，右心導(dǎo)管法測(cè)定平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)。A平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SM-actin)染色顯示肺血管的重建，PCNA染色檢測(cè)細(xì)胞增殖。RT-PCR檢測(cè)肺動(dòng)脈bFGF mRNA表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)bFGF蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果

11、：與C組大鼠比較，煙霧暴露各組大鼠PaO2和mPAP無(wú)明顯改變。S4w組、S8w組和S12w組大鼠肺泡管旁肺小動(dòng)脈肌化比例和煙霧暴露各組大鼠肺小血管壁細(xì)胞的增殖指數(shù)明顯高于C組(P<0.05)。煙霧暴露各組大鼠肺動(dòng)脈bFGF mRNA[(0.327±0.076)、(0.483±0.131)、(0.828±0.207)、(0.743±0.159)]和蛋白的表達(dá)[(0.184±0.012)、(0.230±0.017)、(0.292±0.01

12、3)、(0.325±0.020)]均較C組明顯增強(qiáng)(P<0.05)。大鼠肺小動(dòng)脈肌化比例、肺小血管壁細(xì)胞的增殖指數(shù)與bFGF mRNA和蛋白表達(dá)水平成顯著正相關(guān)。
　　 結(jié)論：煙霧暴露能誘導(dǎo)肺小血管壁細(xì)胞增殖，導(dǎo)致肺血管重建，其程度隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)而加重，bFGF在此過(guò)程中可能起重要作用。
　　 分題2
　　 目的：研究CSE對(duì)大鼠PASMC中bFGF表達(dá)的影響及PKC途徑在其中所起的作用。
　　 方法：組

13、織塊法培養(yǎng)正常Wistar大鼠PASMC。5[％]CSE作用于PASMC不同時(shí)間或PASMC先與PKC特異性抑制劑Ro31-8220預(yù)孵育，然后再暴露于5[％]CSE，RT-PCR檢測(cè)PASMC bFGF mRNA表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)bFGF蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：對(duì)照組PASMC中有少量bFGF mRNA和蛋白表達(dá)(分別為0.093±0.034，0.142±0.013)。暴露于5[％]CSE后4h細(xì)胞內(nèi)bFGF mRNA和蛋