高氧液對腸缺血-再灌注致腸及遠(yuǎn)隔器官損傷的保護(hù)作用及機(jī)理研究.pdf

1、目的:利用家兔建立小腸I/R模型，觀察腸I/R損傷情況以及由此引起的遠(yuǎn)隔器官損傷，并分別采用缺血再灌注過程中靜脈輸注高氧液、缺血再灌注前高氧液預(yù)處理、缺血期經(jīng)腸系膜上動(dòng)脈輸注高氧液及腸腔灌注高氧液等不同的給藥方法和途徑，觀察高氧液對小腸I/R所致腸及遠(yuǎn)隔器官損傷的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)理，為高氧液治療缺血缺氧性疾病提供理論基礎(chǔ)。 方法: (1)高氧液的制備：以500ml生理鹽水為基液，氧氣瓶為氣源，以3L/min

2、氧流量通過連接管道輸入“高氧醫(yī)用液體治療儀”，氧氣經(jīng)過反應(yīng)室輸出端通入基液進(jìn)行溶氧活化處理，經(jīng)15min溶氧后制備成高氧液。 (2)建立動(dòng)物模型：選擇健康、體重2-3kg的雄性家兔，3％戊巴比妥鈉30mg/kg靜脈注射麻醉，開腹分離、無損傷夾夾閉腸系膜上動(dòng)脈，60mim后重新開腹，打開動(dòng)脈夾，恢復(fù)腸系膜上動(dòng)脈血流供應(yīng)，再灌注2h后，重新開腹取標(biāo)本。 (3)動(dòng)物分組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物根據(jù)不同的給藥方式和途徑分為四個(gè)大組(注：各大組

3、中的Sham組為同一組動(dòng)物，只開腹游離但不夾閉SMA，結(jié)束實(shí)驗(yàn)后取材)，具體情況如下：①缺血再灌注期靜脈輸注高氧液：健康家兔32只，隨機(jī)分成4組，每組8只，即假手術(shù)對照組(Sham組)、缺血/再灌注組(I/R組)、缺血期高氧液輸注組(HV1組)和再灌注期高氧液輸注組(HV2組)。HV1組在夾閉SMA后經(jīng)耳靜脈以20ml/kg/h恒速輸入高氧液1h；HV2組則以相同的方式、相同的速度在松開動(dòng)脈夾后輸入等量的高氧液；而I/R組在缺血再灌注期

4、靜脈輸入生理鹽水。 ②缺血再灌注前高氧液預(yù)處理：健康家兔24只，隨機(jī)分成3組，每組8只，即Sham組、缺血/再灌注組(I/R組)及高氧液預(yù)處理組(HP組)。HP組每天用微量泵經(jīng)耳緣靜脈給予20ml/kg高氧液，30分鐘勻速輸完，連續(xù)5天，I/R組以同樣的方法給予等容量生理鹽水。最后一次預(yù)處理結(jié)束24小時(shí)后建立腸I/R模型。 ③缺血期經(jīng)SMA輸注高氧液：健康家兔24只，隨機(jī)分成3組，每組8只，即Sham組、缺血/再灌注組(

5、I/R組)、經(jīng)SMA輸注高氧液組(HS組)。I/R組和HS組用無損傷動(dòng)脈夾夾閉SMA1h，HS組在夾閉SMA后即刻經(jīng)SMA以20ml/kg/h恒速灌注高氧液1h，I/R組則采用同樣方法輸入等容量生理鹽水，松開動(dòng)脈夾再灌注2h后取標(biāo)本。 ④缺血期經(jīng)腸腔灌注高氧液：健康家兔24只，隨機(jī)分成3組，每組8只，即Sham組、缺血/再灌注組(I/R組)、腸腔灌注高氧液組(HL組)。I/R組和HL組用無損傷動(dòng)脈夾夾閉SMA1h，HL組于缺血期

6、以20ml/kg/h恒速向腸腔灌注高氧液1h；I/R組則以相同的方式灌注等量的生理鹽水，松開動(dòng)脈夾再灌注2h后取標(biāo)本。 (5)檢測指標(biāo)：動(dòng)物再灌注2h后在無菌操作下重新開腹，處死前抽取動(dòng)脈血和靜脈血各1ml做血?dú)夥治觯?jì)算小腸氧攝取率(O2ER)；取1ml門靜脈血，定量分析血液中細(xì)菌內(nèi)毒素(BET)；另外抽取靜脈血10ml，低溫離心，分離血清，用來檢測肝功能(GOT、GPT)指標(biāo)、心肌酶譜(LDH、CK及CK-MB)活性；檢測血

7、清中TNF-α、乳酸(D-lactate)水平、MDA含量和SOD、CAT、GSH-Px活性；無菌操作下切取小腸、腸系膜淋巴結(jié)和肺、脾、肝組織作細(xì)菌培養(yǎng)，觀察細(xì)菌移位率；取中段小腸少許及心、肝、肺臟組織，10％中性福爾馬林液固定，制作病理切片，用來觀察各器官的組織病理學(xué)改變；取小腸、心、肝、肺臟用生理鹽水洗三次，濾紙吸干，各取0.5克制備10％組織勻漿，用于檢測組織中MDA含量和SOD、CAT、GSH-Px活性以及肝、肺組織髓過氧化物酶

8、(MPO)活力；摘取右側(cè)肺臟，測定肺通透性指數(shù)及含水率；小腸上皮組織切成1mm3大小的組織塊，用5％戊二醛固定，制備電鏡標(biāo)本，用來觀察小腸上皮細(xì)胞線粒體形態(tài)學(xué)變化并定量分析；取15cm回腸，分離小腸上皮細(xì)胞并制備線粒體，測定線粒體呼吸控制率(RCR)；通過刮片法獲得腸粘膜組織，放入液氮中保存，用于測定腸粘膜組織ATP含量。 結(jié)果: (1)腸I/R損傷后可見腸粘膜損傷嚴(yán)重，電鏡下可見小腸上皮細(xì)胞線粒體嚴(yán)重腫脹、嵴斷裂，線粒

9、體RCR、腸粘膜組織ATP含量及O2ER均明顯降低；小腸組織MDA含量顯著升高，SOD、CAT和GSH-Px活性明顯下降；光鏡下心、肝、肺組織也有明顯損傷；血液中內(nèi)毒素、乳酸和TNF-α水平明顯升高，腸道細(xì)菌出現(xiàn)廣泛移位；肝功能GOT、GPT及心肌酶譜生化指標(biāo)LDH、CK、CK-MB均明顯升高；肺通透性指數(shù)及含水率均升高，肝、肺組織中的MPO活性增加；血清及肝、心、肺組織中的MDA含量升高，SOD、CAT和GSH-Px活性降低。

10、 (2)缺血期和再灌注期靜脈輸注高氧液對小腸粘膜損傷及上皮細(xì)胞線粒體形態(tài)學(xué)改變、線粒體RCR、腸粘膜組織ATP含量及O2ER均沒有明顯改善；與I/R組相比，小腸組織MDA含量及SOD、CAT和GSH-Px活性也沒有顯著改變。但是缺血期靜脈輸注高氧液能夠明顯改善心、肝、肺組織的損傷；降低血液中內(nèi)毒素、乳酸和TNF-α水平，減少腸道細(xì)菌移位率；與I/R組相比，肝功能GOT、GPT及心肌酶譜LDH、CK、CK-MB等生化指標(biāo)以及肺通透性指數(shù)及

11、含水率，肝、肺組織中的MPO活性均有明顯下降，血清及肝、心、肺組織中的MDA含量也明顯降低，SOD、CAT和GSH-Px活性顯著增高；而再灌注期靜脈輸注高氧液沒有改善心、肝、肺組織的損傷，與I/R組相比，各項(xiàng)指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 (3)高氧液預(yù)處理、缺血期經(jīng)SMA輸注高氧液、及經(jīng)腸腔灌注高氧液均能夠明顯改善小腸粘膜損傷及上皮細(xì)胞線粒體形態(tài)學(xué)改變，顯著提高線粒體RCR、腸粘膜組織ATP含量及O2ER；降低小腸組織MDA含量，提高S

12、OD、CAT和GSH-Px活性；同時(shí)明顯改善心、肝、肺組織的損傷；降低血液中內(nèi)毒素、乳酸和TNF-α水平，減少腸道細(xì)菌移位率；明顯降低肝功能GOT、GPT及心肌酶譜LDH、CK、CK-MB等生化指標(biāo)以及肺通透性指數(shù)及含水率，降低肝、肺組織中的MPO活性，還顯著降低血清及肝、心、肺組織中的MDA含量，提高SOD、CAT和GSH-Px活性。 結(jié)論: (1)缺血期靜脈輸注高氧液對小腸I/R損傷沒有明顯的保護(hù)作用，但較為顯著地減

13、輕了腸外遠(yuǎn)隔器官的損傷；而再灌注期靜脈輸注高氧液對I/R損傷的小腸和腸外遠(yuǎn)隔器官均無保護(hù)作用。 (2)缺血再灌注前高氧液預(yù)處理以及缺血期經(jīng)SMA輸注高氧液、經(jīng)腸腔灌注高氧液都能夠明顯減輕小腸I/R導(dǎo)致的腸及遠(yuǎn)隔器官心、肝、肺組織的損傷。 (3)高氧液減輕家兔I/R小腸及遠(yuǎn)隔器官損傷的機(jī)制在于：保護(hù)和增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶的活性，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度；保護(hù)腸粘膜屏障、抑制腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素移位；抑制中性粒細(xì)胞激活及TNF-α生成