聚乙二醇對成年大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞受損軸突的修復作用.pdf

1、既往認為，軸突變性是軸突損傷后缺乏來自胞體的營養(yǎng)物質(zhì)而產(chǎn)生的被動死亡。近年發(fā)現(xiàn)，適當?shù)母深A(yù)措施可以延緩軸突變性。視神經(jīng)（opticnerve,ON）夾傷后，一部分軸突并未在損傷即刻斷裂，而是在傷后因損傷區(qū)微環(huán)境變化及軸突內(nèi)軸漿運輸障礙而逐漸引起繼發(fā)性軸突離斷，最終造成軸突連續(xù)性的喪失。因此，在繼發(fā)性軸突離斷之前給予適當治療，將有可能挽救部分軸突并恢復其功能。聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）是高分子聚合物，無毒、親

2、水并能促使細胞膜修復。本研究旨在探討PEG對成年大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinalganglioncells,RGCs）受損軸突的修復作用。
　　第一部分：建立了一種適用于中樞神經(jīng)變性研究的ON夾傷模型。腦與脊髓組織結(jié)構(gòu)錯綜復雜，神經(jīng)元胞體與走向不一的神經(jīng)纖維混存，難以區(qū)分交織在一起的軸突逆行性及順行性變性，因此不是用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（centralnervoussystem,CNS）軸突變性研究的理想器官。而ON屬CNS白質(zhì)結(jié)構(gòu)

3、，由RGCs軸突和膠質(zhì)細胞組成，成分較為單一，神經(jīng)纖維走向一致，且ON眶內(nèi)段易于損傷、實驗操作與觀察。我們用鑷端寬度1mm與夾持力148g的小號動脈阻血鑷于球后2mm處夾持左側(cè)ON，致傷時間10s。術(shù)后隨機分為兩組（每組6只）：一組動物術(shù)后立即于雙側(cè)上丘表面放置逆行熒光染料熒光金（FluroGold,FG)，72h后處死。取雙側(cè)視網(wǎng)膜鋪片，ON冰凍連續(xù)切片。另一組動物術(shù)后72h常規(guī)灌注固定，取ON冰凍連續(xù)切片，分別行β-tubulin及

4、NF-M免疫組化染色和HE染色。結(jié)果顯示左側(cè)ON夾傷后3d，同側(cè)視網(wǎng)膜內(nèi)未見FG逆行標記的RGCs，ON基質(zhì)連續(xù)，夾傷部位形成一條寬達1mm的損傷帶，F(xiàn)G標記的神經(jīng)纖維被阻斷于損傷遠側(cè)，損傷遠側(cè)的?-tublin陽性纖維多已崩潰，NF-M陽性纖維數(shù)量較多，部分纖維末梢形成膨大的回縮球。表明ON夾傷后神經(jīng)元軸突完全離斷，中樞神經(jīng)基質(zhì)的連續(xù)性得以保持，損傷遠側(cè)段軸突發(fā)生典型的沃勒變性(Walleriandegeneration)，從而為中樞

5、神經(jīng)沃勒變性及其藥物治療研究的篩選和評估提供了簡單實用的實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　第二部分：采用上述ON夾傷模型，研究大鼠ON夾傷后PEG對RGCs受損軸突的修復作用。72只成年雌性SD大鼠隨機分為PEG治療和PBS對照兩大組，每組再分為FG上丘逆行標記和免疫組化亞組，每亞組6只動物。夾傷動物ON后，治療組和對照組立即分別在ON損傷區(qū)放置浸有PEG(MW-2000;50％,w/v)或PBS(0.0lmol/L,pH7.4)的明膠海綿，放置時

6、間為2min。FG上丘標記組動物處死前3d在雙側(cè)上丘放置FG，并在ON夾傷后3d、7d和14d取出左側(cè)視網(wǎng)膜平鋪，熒光顯微鏡下計數(shù)FG標記的RGCs。免疫組化組動物ON夾傷3d、7d和14d過量麻醉處死動物灌注取ON行連續(xù)冰凍切片，免疫組化NF-M染色，熒光顯微鏡下分別計數(shù)距損傷區(qū)近側(cè)端和遠側(cè)端250μm及500μm處長度大于25μm的NF-M染色陽性神經(jīng)纖維數(shù)量。結(jié)果顯示：（1）3d時治療和對照兩組動物視網(wǎng)膜內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)FG標記的RGC

7、s，而在7d和14d時治療組RGCs均數(shù)(523.60±51.92和896.00±16.67)均顯著高于對照組(222.00±91.09和449.25±36.25，p<0.01)。（2）相同時間點距損傷區(qū)不同距離NF-M染色陽性纖維均數(shù)的比較：3d時間點除近側(cè)段250μm處治療組神經(jīng)纖維均數(shù)(12.85±4.09)顯著高于PBS對照組(6.38±3.92，p<0.01)外，近側(cè)段距損傷區(qū)500μm處、遠側(cè)段距損傷區(qū)500μm處和250μ

8、m處治療組(18.00±2.17、19.00±3.24和17.45±2.17)與對照組(12.95±3.97、17.26±1.97和13.28±6.94)間均無顯著性差異(p>0.05）。7d時間點在所有4個距離點（即近側(cè)段250μm及500μm處，以及遠側(cè)段距損傷區(qū)500μm和250μm處），治療組纖維均數(shù)(21.98±1.52、17.98±2.15、18.77±2.58和18.90±3.72)均較對照組(13.79±5.09、12.

9、94±7.16、13.67±3.19和12.63±3.91)顯著增多(p<0.05)14d時間點在近側(cè)段距損傷區(qū)500μm處、250μm處及遠側(cè)段距損傷區(qū)500μm處神經(jīng)纖維均數(shù)(11.50±1.73、14.33±4.05和13.67±2.37)顯著高于對照組(6.94±1.05、6.17±2.13和10.16±3.03，p<0.05)。遠側(cè)段250μm處治療組與對照組(11.53±4.26和9.72±3.14)間無顯著性差異(p>0.

10、05）。（3）不同時間點距損傷區(qū)相同距離神經(jīng)纖維均數(shù)的比較：近側(cè)段距損傷區(qū)500μm處在3d時間點，治療組(18.00±2.17)與對照組(12.95±3.97)間無顯著性差異(p>0.05)；而在7d和14d時間點治療組(21.98±1.52和11.50±1.73)明顯高于對照組(13.79±5.09和6.94±1.05,p<0.01）。近側(cè)段距損傷區(qū)250μm處在3d、7d和14d時間點，治療組(12.85±4.09、17.98±2

11、.15和14.33±4.05)顯著高于對照組(6.38±3.92、12.94±7.16和6.17±2.13，p<0.05)。遠側(cè)段距損傷區(qū)250μm處3d和14d時治療組(17.45±2.17和11.53±4.26)與對照組(13.28±6.94和9.72±3.14)間無顯著差異(p>0.05)，而7d時治療組纖維數(shù)(18.90±3.72)顯著高于對照組(12.63±3.91，p<0.01）。遠側(cè)段距損傷區(qū)500μm處3d時治療組(19