胚胎血紅蛋白基因在人工流產(chǎn)和自然流產(chǎn)胚胎中的表達(dá).pdf

1、目的 自然流產(chǎn)是生育年齡婦女最常見的疾患之一，生育年齡的婦女，15～20﹪的臨床妊娠以自然流產(chǎn)為結(jié)局。流行病學(xué)調(diào)查研究認(rèn)為，自然流產(chǎn)是一種多病因疾病。目前已經(jīng)明確的自然流產(chǎn)的主要原因仍然是胚胎染色體的異常。母體生殖道解剖異常、內(nèi)分泌異常、免疫紊亂、凝血功能異常、代謝異常等也可能導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。但即使經(jīng)過詳細(xì)嚴(yán)格的病因篩查，仍有40～60﹪的自然流產(chǎn)病因不明，這使臨床上自然流產(chǎn)的有效治療受到限制，也給臨床遺傳咨詢醫(yī)生指導(dǎo)患者再次妊

2、娠帶來困難，也使自然流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制的研究成為優(yōu)生遺傳和輔助生育技術(shù)中的熱點(diǎn)之一。多年前，由于檢測(cè)條件的限制以及人類基因組的復(fù)雜性和多樣性，人們主要研究流產(chǎn)組織的核型。近年來，隨著分子細(xì)胞遺傳學(xué)的進(jìn)步和人類基因組工程的完成，對(duì)流產(chǎn)組織的分析逐漸進(jìn)入分子水平。研究表明，絨毛組織的免疫相關(guān)基因群、血管發(fā)生相關(guān)基因群、凋亡相關(guān)基因群和其他一些未確定的基因與自然流產(chǎn)有關(guān)。但是，至今未確定某個(gè)基因在自然流產(chǎn)的胚胎停育中有致死突變作用。 妊娠早

3、期，尤其孕8周前，胚胎相對(duì)處于低氧環(huán)境。因此，任何原因的波動(dòng)容易造成氧供不足，都可能會(huì)加重胚胎缺氧，影響胚胎發(fā)育，導(dǎo)致自然流產(chǎn)。目前已知的某些自然流產(chǎn)發(fā)病相關(guān)因素或因子或許是通過影響胚胎氧供和營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致胚胎停育的。最能影響胚胎氧供和營(yíng)養(yǎng)的其實(shí)是血液系統(tǒng)的直接改變。國際上一些研究已經(jīng)揭示了這個(gè)可能性，但都沒有明確提出，胚胎血液系統(tǒng)的異常可能導(dǎo)致自然流產(chǎn)。而胚胎血紅蛋白是胚胎血液系統(tǒng)的重要功能組分，它對(duì)胚胎的正常發(fā)育是非常重要的，所以胚胎血紅

4、蛋白基因(ε、ζ基因)的序列在不同種屬和個(gè)體發(fā)育過程中都非常保守，因?yàn)檫@些基因序列的改變對(duì)胚胎發(fā)育有致死作用。這兩個(gè)基因由于自身突變或在微環(huán)境干擾下表達(dá)異常或失衡，是否是自然流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制的重要途徑，是一個(gè)值得探討的課題。通過對(duì)胚胎發(fā)育的深入理解，并對(duì)現(xiàn)有研究文獻(xiàn)進(jìn)行廣泛閱讀和分析，本研究以胚胎絨毛組織里有核紅細(xì)胞的ε、ζ基因?yàn)槟康幕颍ㄟ^半定量RT-PCR對(duì)流產(chǎn)胚胎ε、ζ基因的表達(dá)特性進(jìn)行量化研究，并進(jìn)一步以熒光定量RT-PCR驗(yàn)證，

5、對(duì)胚胎血紅蛋白基因在自然流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制中可能的作用進(jìn)行了探討，豐富了自然流產(chǎn)的發(fā)病學(xué)理論，并使我們對(duì)正常妊娠的維持有更深入的理解。 資料與方法 1樣本收集： 2006年4月至2006年12月共收集35例在我院行人流清宮術(shù)的婦女。其中，病例組20例自然流產(chǎn)婦女，自然受孕，平素月經(jīng)周期規(guī)則，末次月經(jīng)記憶準(zhǔn)確，有或無類似病史。B超檢查證實(shí)宮內(nèi)妊娠、胚胎停育。按B超提示胚胎停育時(shí)的孕周分3組：孕42天～48天(孕6周組)，

6、孕49天～55天(孕7周組)，孕56天～62天(孕8周組)。 對(duì)照組15例人工流產(chǎn)婦女，自然受孕，平素月經(jīng)周期規(guī)則，末次月經(jīng)記憶準(zhǔn)確，至少有一次成功妊娠史，B超證實(shí)宮內(nèi)胚胎存活。也按孕周分為3組。 無菌收集人流清宮后的絨毛組織50～100mg，置于TRIzol里-80℃保存。 2提取RNA： 組織放在TRIzol里勻漿后，加入0.2ml氯仿離心，取上清與異丙醇混勻離心，沉淀出的RNA用預(yù)冷的75﹪乙醇洗滌

7、離心2次，1‰DEPC水溶解后紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品于260nm和280nm處的吸光度，測(cè)定RNA純度和濃度。 3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)： 每樣本取2ug抽提的RNA用First Strand cDNA Synthesis Kit-Rever Tra Ace-α-TM試劑盒逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。反應(yīng)程序按試劑說明書進(jìn)行。 4半定量RT-PCR： 逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA進(jìn)行目的基因和內(nèi)參基因(GAPDH)的擴(kuò)增，瓊脂糖電泳后EB

8、染色，紫外凝膠成像系統(tǒng)下對(duì)凝膠圖像灰度值進(jìn)行分析，對(duì)ε、ζ基因相對(duì)GAPDH的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。 5熒光定量RT-PCR： 逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增ε、ζ基因，測(cè)定各樣本ε和ζ基因的Ct值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線反應(yīng)系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算起始cDNA拷貝數(shù)。 6統(tǒng)計(jì)分析： 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，用t檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)方法對(duì)半定量RT-PCR和熒光定量RT-PCR測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別以均數(shù)、

9、標(biāo)準(zhǔn)差、中位數(shù)和四分位數(shù)間距進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果 1凝膠圖像灰度值觀察1.1 15例對(duì)照組都能檢測(cè)到目的基因和GAPDH的表達(dá)，且ε、ζ基因和GAPDH的條帶灰度值一致性高。 1.2 20例病例組中有16例ε、ζ基因和GAPDH的灰度值不一致。其中，12例樣本表現(xiàn)為‘基因條帶灰度值明顯降低，2例樣本表現(xiàn)為ε基因條帶灰度值明顯降低，2例樣本表現(xiàn)為ε、ζ基因條帶灰度值都明顯降低。

10、 1.3 20例病例組中，孕6周組有1例、孕7周組有1例均未能檢測(cè)出ζ基因的表達(dá)。 1.4 20例病例組中，孕8周組有2例其條帶灰度值表現(xiàn)與對(duì)照組類似。2半定量測(cè)定正常胚胎與自然流產(chǎn)胚胎ε、ζ基因的相對(duì)表達(dá)量并比較2.1病例組共有2例未能檢測(cè)出ζ基因表達(dá)，孕8周病例組有2個(gè)樣本條帶灰度值的半定量分析與正常組類似。除2個(gè)未能檢測(cè)出ζ基因的表達(dá)的樣本外，余33個(gè)樣本均納入半定量測(cè)定的統(tǒng)計(jì)分析。 2.2孕6周、孕7周病例組ε基因的相對(duì)

11、表達(dá)量與同孕周對(duì)照組相比，均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)。孕8周病例組e基因的相對(duì)表達(dá)量與同孕周對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＃P>0.05)，考慮可能與病例組里有2個(gè)樣本條帶灰度值的半定量分析與正常組類似有關(guān)。 2.3孕6周、孕7周和孕8周病例組ζ基因的相對(duì)表達(dá)量與同孕周對(duì)照組相比，均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)。3熒光定量RT-PCR測(cè)定35例樣本ε、ζ基因的表達(dá)并比較3.1半定量分析時(shí)病例組有2例未能檢

12、測(cè)出ζ基因表達(dá)的樣本，在熒光定量RT-PCR中1例可以檢測(cè)出ζ基因的表達(dá)，但cDNA拷貝數(shù)很低，只有17.95copy/ul。另外1例始終沒有檢測(cè)出ζ基因的表達(dá)。這兩個(gè)樣本沒有納入統(tǒng)計(jì)范圍。 3.2與同孕周對(duì)照組相比，孕6周、孕7周和孕8周病例組ε基因的表達(dá)量下降，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)。 3.3與同孕周對(duì)照組相比，孕6周、孕7周和孕8周病例組ζ基因的表達(dá)量下降，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)。

13、 結(jié)論 1流產(chǎn)胚胎的絨毛組織可以檢測(cè)出表達(dá)ε、ζ基因的胚胎有核紅細(xì)胞，造血細(xì)胞是胚胎源性，它能提供有關(guān)胚胎遺傳物質(zhì)的準(zhǔn)確信息。這是直接研究流產(chǎn)胚胎遺傳物質(zhì)非常有意義的胎兒細(xì)胞。 2各孕周病例組ε、ζ基因的表達(dá)水平下降甚至缺失，與同孕周對(duì)照組相比，這種差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。自然流產(chǎn)胚胎ε、ζ基因表達(dá)異?？梢允腔蛲蛔兊姆从常部赡苁求w內(nèi)外環(huán)境綜合作用使基因轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平異常導(dǎo)致，這可能是自然流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制中主要的共同

14、通道之一。 3自然流產(chǎn)胚胎η基因的表達(dá)水平下降表現(xiàn)比ε基因明顯。ζ蛋白對(duì)胚胎血紅蛋白的氧結(jié)合運(yùn)輸功能影響比ε蛋白大，ζ基因可能與自然流產(chǎn)的關(guān)系更密切。 4自然流產(chǎn)胚胎中也有ε、ζ基因表達(dá)水平如正常胚胎的情況。自然流產(chǎn)是一多病因疾病，胚胎血紅蛋白基因表達(dá)異?？赡苁亲匀涣鳟a(chǎn)發(fā)病機(jī)制中主要的共同通道之一，但不是唯一的通道，可能有其他因素在起作用。 但是，我們不知道這種基因表達(dá)量的差異，究竟是基因突變的反映還是體內(nèi)外環(huán)境