胚胎血紅蛋白基因變異與自然流產(chǎn)的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　 自然流產(chǎn)是育齡婦女最常見的疾患之一。生育年齡的婦女，15～20％的臨床妊娠以自然流產(chǎn)為結(jié)局；包括生化妊娠在內(nèi)自然流產(chǎn)發(fā)生率可達30％～40％；約5％的育齡婦女會發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。自然流產(chǎn)發(fā)生的危險性隨著妊娠丟失次數(shù)的增加而增加，在連續(xù)2次胚胎丟失后，第三次胚胎丟失的危險性高達80％。
　　 自然流產(chǎn)尤其是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因復(fù)雜，遺傳學(xué)異常、免疫因素是早期自然流產(chǎn)的主要原因，內(nèi)分泌異常、解剖學(xué)異常、凝血功能異常、感

2、染等亦被認為可導(dǎo)致自然流產(chǎn)，但即使經(jīng)過嚴格的病因檢查，仍然有40～60％的自然流產(chǎn)病因不明。探討自然流產(chǎn)的發(fā)病成為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)倍受關(guān)注的研究方向之一。
　　 RSA多數(shù)發(fā)生于妊娠的12周內(nèi)，對于早期胚胎，在絨毛膜絨毛血管發(fā)生并建立有效胎盤循環(huán)之前，卵黃囊循環(huán)為胚胎發(fā)育提供穩(wěn)定有效的營養(yǎng)、氧氣支持。擴散至胚外體腔的營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣依賴卵黃囊循環(huán)運送至胚胎體內(nèi)，胚胎處于低氧狀態(tài)，任何原因造成血氧供應(yīng)不足，都可影響胚胎發(fā)育甚至導(dǎo)致胚胎丟

3、失。胚胎血紅蛋白作為胚胎期主要的攜氧供氧載體，對胚胎的正常發(fā)育非常重要。
　　 人類血紅蛋白基因表達有著嚴格的時空特異性，在個體不同的發(fā)育階段，基因簇上各個類α、β珠蛋白基因按其在染色體上自5'-3'的排列順次表達。ζ和ε基因表達于胚胎早期，該基因幾乎存在于所有哺乳動物基因中，提示此基因在物種進化淘汰中更具有生存優(yōu)勢；且ζ、ε基因表達時間與臨床上自然流產(chǎn)高發(fā)時間段一致，推測該基因與自然流產(chǎn)發(fā)生具有高度相關(guān)性。這兩個基因由于自身突

4、變或在微環(huán)境干擾下表達異常或失衡，是否為自然流產(chǎn)發(fā)病機制的重要途徑，是一個值得探討的課題。本課題將通過對自然流產(chǎn)胚胎中ε、ζ基因進行突變及多態(tài)性篩查，以探討該基因變異與自然流產(chǎn)的關(guān)系。
　　 材料與方法：
　　 1.樣本收集：
　　 2008年3月-2009年4月在中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院黃埔院區(qū)婦產(chǎn)科門診人流室行人流清宮術(shù)的婦女，無菌收集其絨毛組織。其中，研究組40例，平均年齡28.2歲，自然受孕，平素月經(jīng)周

5、期規(guī)則，末次月經(jīng)記憶準(zhǔn)確，既往有或無類似病史，B超提示：胚胎停止發(fā)育，胚胎停育時孕周為6～8周；對照組35例，平均年齡27.5歲，自然受孕，平素月經(jīng)周期規(guī)則，末次月經(jīng)記憶準(zhǔn)確，至少有一次成功妊娠史，B超證實宮內(nèi)妊娠存活，孕周為6～8周，既往無自然流產(chǎn)史。
　　 另外補充收集母體外周血標(biāo)本。研究組收集2009年4月-2009年10月在中山大學(xué)干細胞中心研究所進行主動免疫治療的婦女外周血50例，平均年齡27.8歲，有≥2次以上不明原

6、因自然流產(chǎn)病史，平均流產(chǎn)次數(shù)為3.1次。對照組收集2009年4月-2009年10月在中山大學(xué)一院黃埔院區(qū)體檢中心進行體檢的婦女外周血50例，平均年齡28.3歲，既往至少有一次成功妊娠史，否認有自然流產(chǎn)史或死胎史。
　　 無菌收集新鮮絨毛的胚胎組織約50-100mg，無菌生理鹽水漂洗去除母體血污染，置于EP管內(nèi)，-80℃保存；無菌收集外周血標(biāo)本約2ml，置于EP管內(nèi)，-80℃保存。
　　 2.提取DNA：
　　 根

7、據(jù)AXYGEN DNA提取試劑盒說明按步驟提取DNA，紫外分光光度計測定DNA溶液的純度及濃度。
　　 3.引物設(shè)計：
　　 從UCSC Genome Bioinformatics數(shù)據(jù)庫中提取ε基因、ζ基因相關(guān)序列作為標(biāo)準(zhǔn)序列。運用Primer Premier5軟件，針對3個外顯子及部分內(nèi)含子、上游調(diào)控序列分片段設(shè)計引物。
　　 4.PCR擴增目的片段：
　　 取絨毛組織DNA2ul PCR擴增各個目的片

8、段，反應(yīng)程序按TaKaRa rTaq酶試劑盒程序說明書進行。取母體外周血DNA2ul擴增絨毛組織DNA篩選出的異?；蚱?。
　　 5.電泳：
　　 每個PCR產(chǎn)物各取5ul加樣至2％的瓊脂糖凝膠樣品槽孔中電泳。通過UVPTransilluminator凝膠掃描系統(tǒng)(M-26)成像，紫外燈下觀察電泳膠板，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)分子量(Marker)比較，判斷PCR結(jié)果。
　　 6.測序：
　　 應(yīng)用ABI公司的ABI P

9、rism3100-Avant遺傳分析儀對絨毛組織DNA PCR產(chǎn)物純化測序。測序結(jié)果通過CLUSTALX軟件與標(biāo)準(zhǔn)序列比對，確定突變位點及突變性質(zhì)。
　　 7統(tǒng)計分析：
　　 所有數(shù)據(jù)均用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，獨立的兩組二分類資料比較，采用卡方檢驗及Fisher確切概率法，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；兩變量關(guān)聯(lián)性分析，采用卡方檢驗，P＜0.05認為相關(guān)性有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:

10、　　 1、胚胎絨毛組織ε、ζ基因篩查共6個外顯子片段未發(fā)現(xiàn)突變。
　　 2、胚胎絨毛組織ε基因第一內(nèi)含子84位點處發(fā)現(xiàn)插入4bpCAAA序列，該變異同時出現(xiàn)在研究組中及對照組中，兩組基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3、胚胎絨毛組織ζ基因第一內(nèi)含子128位點處發(fā)現(xiàn)插入58bp序列，該變異同時出現(xiàn)于研究組中及對照組中，兩組基因型頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，關(guān)聯(lián)性分析提示該基因片段變異與自然流產(chǎn)相關(guān)。
　　 4、胚胎絨

11、毛組織ζ基因變異研究組中出現(xiàn)2例純合子，對照組僅出現(xiàn)雜合子，純合子基因型頻率兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 5、胚胎絨毛組織自然流產(chǎn)1次組與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組ζ基因變異基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 6、母體外周血ζ基因第一內(nèi)含子58bp插入變異篩查，該變異同時出現(xiàn)在研究組及對照組，兩組基因型頻率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，關(guān)聯(lián)性分析提示該基因片段變異與自然流產(chǎn)相關(guān)。
　　 7、母體外周血ζ基因第一內(nèi)含子58bp插入變異研

12、究組中出現(xiàn)2例純合子，對照組僅出現(xiàn)雜合子，純合子基因型頻率兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、ζ基因第一內(nèi)含子存在一58bp插入序列，該基因多態(tài)性與自然流產(chǎn)相關(guān)。
　　 2、ε基因內(nèi)含子存在一4bp插入序列，該基因多態(tài)性與自然流產(chǎn)無相關(guān)性。
　　 3、自然流產(chǎn)胚胎在本研究中未發(fā)現(xiàn)ε、ζ基因外顯子突變。
　　 4、母體外周血該ζ基因多態(tài)位點可否作為自然流產(chǎn)風(fēng)險篩查指標(biāo)之一，尚需大樣本研究