抗百菌清和腐霉利單克隆抗體制備及其特性分析.pdf

1、有機(jī)氯農(nóng)藥化學(xué)性質(zhì)極為穩(wěn)定，在環(huán)境中降解緩慢，可通過(guò)食物鏈蓄積于人體脂肪組織，對(duì)人體健康造成危害。因此，快速準(zhǔn)確的分析測(cè)定其在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留水平就顯得十分重要。
　　 本文以有機(jī)氯農(nóng)藥中使用較為廣泛的百菌清（CTN）和腐霉利（PRM）為研究對(duì)象，對(duì)CTN和PRM進(jìn)行化學(xué)修飾后，采用N，N-羰基二咪唑法（CDI）將它們分別與載體蛋白連接，獲得了CTN和PRM的完全抗原，然后采用兩種抗原同時(shí)混合免疫以及常規(guī)單獨(dú)免疫的方法獲得抗血清，

2、通過(guò)雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，制備得到了抗CTN和PRM克隆子，并對(duì)單克隆抗體的特性進(jìn)行了分析，具體內(nèi)容如下。
　　 1.百菌清和腐霉利人工抗原的制備
　　 CTN和PRM的分子量分別為265.9和284.1，屬于只有反應(yīng)原性而無(wú)免疫原性的半抗原（hapten），必須與蛋白質(zhì)等載體結(jié)合構(gòu)建成完全抗原才能刺激動(dòng)物產(chǎn)生抗體。根據(jù)CTN和PRM都具備苯環(huán)上連有氯原子的特點(diǎn)，先以乙二醇取代苯環(huán)上的氯原子，制得2-羥基取代百菌清（CTNH）

3、和3-羥基取代腐霉利（PRMH），然后采用CDI法使它們分別與牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（oVA）偶聯(lián)，制備得到免疫抗原CTNH-BSA與PRMH-BSA，包被抗原CTNH-OVA與PRMH-OVA，以紫外和紅外光譜對(duì)偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行了分析，結(jié)果表明CTNH和PRMH與BSA和OVA偶聯(lián)成功，偶聯(lián)摩爾比為CTNH：BSA=11：1，CTNH：OVA=8：1，PRMH：BSA=9：1，PRMH：OVA=8：1。
　　 2.抗百菌

4、清和腐霉利抗血清制備及其性質(zhì)研究
　　 將CTNH-BSA、PRMH-BSA分別（100μg/只）和等量混合后（總量分別為100μg/只、200pg/只），以多點(diǎn)、多次注射的方法免疫BALB/c小鼠。對(duì)抗體的產(chǎn)生進(jìn)程分析發(fā)現(xiàn)，從第25d開(kāi)始有明顯抗體產(chǎn)生，第55d抗體的ELISA效價(jià)最高達(dá)1：12800。
　　 以上述制備的抗原和抗體為材料，通過(guò)方陣滴定實(shí)驗(yàn)得到競(jìng)爭(zhēng)ELISA的抗原抗體濃度如下：抗原混合免疫組6號(hào)小鼠抗血

5、清以pH7.4的磷酸鹽緩沖液生理鹽水（PBS）稀釋至1：12800，CTNH-OVA和PRMH-OVA的包被濃度均為8μg/mL；抗原單獨(dú)免疫組7號(hào)小鼠抗血清稀釋倍數(shù)為1：12800，CTNH-OVA的包被濃度為4μg/mL；11號(hào)小鼠抗血清稀釋倍數(shù)為1：6400，PRMH-OVA的包被濃度為2μg/mL。
　　 根據(jù)上述條件，按常規(guī)ELISA的條件進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析，以競(jìng)爭(zhēng)抗原的濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，競(jìng)爭(zhēng)抑制率為縱坐標(biāo)，得到抗

6、原混合組6號(hào)小鼠針對(duì)CTN和PRM的抑制曲線(xiàn)，分別為y=26.08x+98.933，（R2=0.973）；y=24.0x+100.4，（R2=0.982），CTN和PRM的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為79 ng/mL和125ng/mL，對(duì)兩種抗原的線(xiàn)性檢測(cè)范圍均為10ng/mL～1000ng/mL?？乖瓎为?dú)免疫組7號(hào)小鼠的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(xiàn)方程為y=23.58x+91.933，（R2=0.979），CTN的半數(shù)抑制濃度（IC50）為59ng

7、/mL，線(xiàn)性檢測(cè)范圍為10ng/mL～1000ng/mL：11號(hào)小鼠的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(xiàn)方程為v=-31.08x+119.27，（R2=0.976），PRM的半數(shù)抑制濃度（IC50）為93ng/mL，線(xiàn)性檢測(cè)范圍為10ng/mL～1000ng/mL。
　　 3.抗百菌清和腐霉利單克隆抗體的制備及其ELISA的建立
　　 抗原混合免疫的小鼠在第四次免疫采血后，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/O進(jìn)行融合，融合率為50.3％。采用有限

8、稀釋法，從陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株中篩選得到針對(duì)CTN和PRM能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株各1株，分別命名為1H4和5C2。
　　 以上述制備的抗原和抗體為材料，通過(guò)方陣滴定實(shí)驗(yàn)得到了CTN和PRM的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的包被抗原（CTNH-OVA和PRMH-OVA）的濃度分別為2μg/mL和4μg/mL，1H4和5C2培養(yǎng)上清液的稀釋倍數(shù)分別為1：64和1：32，針對(duì)CTN和PRM的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(xiàn)分別為：y=-25.08x+93.2