貓杯狀病毒的分離鑒定及其單克隆抗體制備.pdf

1、貓杯狀病毒（Feline calicivirus,FCV）屬于杯狀病毒科的成員之一，是貓的一種重要病原。FCV感染貓后最常表現(xiàn)為上呼吸道炎癥，同時也可引起其它臨床疾病，如慢性胃腸炎和齒齦炎、跛行、流產、出血熱、尿道感染等。近年來，有高致病性的FCV毒株（VSD-FCV）在一些國家相繼爆發(fā)，該毒株可引起感染貓全身性多系統(tǒng)病變，死亡率較高。FCV在我國貓科動物中感染較為嚴重，但尚未見VSD-FCV毒株的病原研究相關報道。因此，開展我國 FC

2、V病毒分離及其基因序列分析，了解我國FCV與世界各地分離株之間的進化關系，并建立FCV檢測方法，對FCV的防治具有重要意義。
　　本論文主要研究內容和結果如下：
　　1. FCV分離鑒定與序列分析
　　本研究于2014年6月至9月間從湖北省武漢市某寵物醫(yī)院采集19只就診貓的鼻拭子、眼拭子和口腔拭子樣品共38份，病料處理后接種 F81細胞，有13份樣品出現(xiàn)細胞病變（Cytopathic effect,CPE），用FCV的

3、特異性引物進行RT-PCR鑒定，結果顯示出現(xiàn)CPE的樣品均為FCV陽性，證實分離到了13株FCV病毒。選其中一株病毒W(wǎng)H7-92113采用FCV特異性引物擴增全基因組序列以及利用電鏡觀察病毒形態(tài)，進一步證實為FCV。此外，為了分析我國FCV分離株的分子遺傳學特性，對分離所得13株FCV武漢分離株進行ORF2（B-F區(qū)）片段測序，并和我國前期報道的8株FCV分離株以及世界各國分離株進行ORF2（B-F區(qū)）基因序列和遺傳進化關系分析。結果顯

4、示，我國多株分離株與日本報道的II型的毒株遺傳距離較近，與世界其它各國分離株遺傳距離較遠。
　　2.FCV WH7-92113株衣殼蛋白原核表達與純化
　　采用RT-PCR方法擴增FCV WH7-92113株ORF2 B-F區(qū)基因，將所得片段克隆至pET-30a表達載體，轉化至DH5α大腸桿菌中，鑒定篩選出陽性克隆，并經(jīng)測序證實 pET30a-ORF2原核表達載體構建成功，將該載體轉化到大腸桿菌BL21菌株中，經(jīng) IPTG誘

5、導后收集菌體，進行 SDS-PAGE。結果表明，目的蛋白主要以包涵體的形式表達。大量表達的目的蛋白經(jīng)純化后，采用 ELISA方法檢測該蛋白的抗原性，結果顯示該蛋白具有較好的反應原性。
　　3. FCV單克隆抗體的制備
　　以FCV WH7-92113為抗原多次免疫BALB/c小鼠后，取血清效價高的小鼠脾臟制備免疫脾細胞，在PEG4000的作用下與活化的SP2/0細胞進行融合，隨后采用以FCV為抗原的間接ELISA方法對融合成