抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的制備及其應(yīng)用.pdf

1、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是一類主要由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)產(chǎn)生的真菌毒素，廣泛存在于玉米、大麥、燕麥、小麥、大米和高粱等糧食作物中。它性質(zhì)穩(wěn)定、能耐高溫，可引起動物發(fā)生雌激素中毒癥，對人也有一定的毒害作用。ZEN不僅具有生殖發(fā)育毒性、免疫毒性、肝毒性、細(xì)胞毒性和遺傳毒性，對腫瘤的發(fā)生及內(nèi)分泌系統(tǒng)也有一定的影響。
　　目前，用于檢測玉米赤霉烯酮的分析方法主要分為三類：色譜檢測法、微

2、生物檢測法和免疫學(xué)檢測法。這些方法各有利弊，比較而言，專一性強(qiáng)、靈敏度高、快速方便、操作簡單、成本低、可一次性檢測大量樣品的免疫學(xué)檢測法(比如應(yīng)用單克隆抗體的ELISA檢測方法)顯得更為方便實(shí)用，越來越受到檢測機(jī)構(gòu)的歡迎和研究人員的重視。
　　國內(nèi)針對ZEN的檢測試劑盒目前仍主要來源于進(jìn)口，價(jià)格十分昂貴。因此，建立其靈敏、可靠、快速的ELISA檢測法，發(fā)展高質(zhì)量的國產(chǎn)試劑盒具有重要意義，可以為我國進(jìn)行糧食和飼料中ZEN的污染情況調(diào)

3、查及制定國標(biāo)ZEN建議值提供技術(shù)支持。
　　本研究采用羧甲基羥胺半鹽酸鹽一步合成出半抗原，然后直接用活潑酯法將半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成完全抗原，并利用單克隆抗體技術(shù)制備了靈敏度高、專一性強(qiáng)、效價(jià)高及穩(wěn)定性好的抗體，建立了ZEN的CI-ELISA檢測方法。小麥樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)說明了本實(shí)驗(yàn)建立的CI-ELISA檢測方法是穩(wěn)定、可靠的。
　　1、半抗原及全抗原的合成與鑒定。采用羧甲基羥胺半鹽酸鹽一步合成出半抗原，然后直接用活潑酯法將

4、半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，操作步驟簡單，而且所使用的試劑都很普通，容易獲得。通過TLC、HPLC和液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)三種方法依次進(jìn)行半抗原的鑒定；采用紫外光譜法、結(jié)合比的測定以及免疫學(xué)方法進(jìn)行全抗原的檢測，結(jié)果皆表明目標(biāo)半抗原及全抗原合成成功。
　　2、ZEN單抗的制備及鑒定。用ZEN-BSA免疫8周齡BALB/C小鼠，五免后血清效價(jià)在1:8000以上。利用細(xì)胞融合技術(shù)和單克隆抗體技術(shù)，篩選到1株可穩(wěn)定分泌針對ZEN的抗體的雜交瘤細(xì)胞

5、株3D10。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該細(xì)胞上清中抗體的穩(wěn)定性較好，效價(jià)基本保持不變。用3D10雜交瘤細(xì)胞株制備腹水，腹水效價(jià)可以達(dá)到1×106。其與ZEN結(jié)構(gòu)類似物有一定的交叉反應(yīng)，而與其他三種參試真菌毒素基本沒有交叉反應(yīng)，說明其特異性較高。腹水對ZEN具有較高的靈敏度，抑制曲線的線性回歸方程為Y=1.0669-0.241X(R2=0.9869)，IC50值為0.225μg/mL，IC10值為4.93ng/mL。
　　3、CI-ELISA檢

6、測方法的建立。確定了間接競爭ELISA的最佳工作條件：最佳封閉條件為2％濃度的脫脂奶粉(PBS溶解)；包被抗原的最佳工作濃度為2μg/mL；腹水的最佳稀釋倍數(shù)為1×106倍；樣品提取液乙腈的最佳濃度為10％。在本實(shí)驗(yàn)建立的CI-ELISA最佳工作條件下，建立ZEN CI-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為Y=0.0807-0.0313X，R2=0.9906，標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.01μg/mL～10μg/mL范圍內(nèi)，呈良好線性。
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