系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清沙眼衣原體熱休克蛋白60特異性抗體的檢測及意義.pdf

1、目的:
　　1.檢測系統(tǒng)系紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)患者血清中是否存在沙眼衣原體熱休克蛋白60(Chlamydia trachomatis heat shock protein60，CHSP60)特異性抗體。
　　2.鑒定和分析可誘導SLE患者產生特異性抗體的CHSP60全長蛋白的B細胞表位。
　　方法:
　　1.采用PCR法擴增沙眼衣原體E血清型HSP60全長基

2、因，構建至pET21a(+)載體上，獲得重組質粒pET21a(+)/CHSP60，經測序鑒定正確后，將重組質粒轉入至Rosetta表達菌株，通過原核系統(tǒng)表達CHSP60融合蛋白，經SDS-PAGE和Westernblot分析鑒定后，采用Ni-NTA親和層析柱純化目的蛋白。
　　2.動物免疫實驗:選擇4-6周雌性BALB/c小鼠，每組6只，用純化的CHSP60融合蛋白作為免疫原，分別于實驗的第1w、3w和5w進行免疫，并設PBS組作

3、為陰性對照組。在實驗的第0w、2w、4w、6w和8w，斷尾取血，獲得小鼠血清。采用間接ELISA方法檢測CHSP60融合蛋白的免疫原性。
　　3.以SLE患者血清作為一抗，Western blot檢測SLE患者血清對CHSP60融合蛋白的識別能力。摸索ELISA檢測最適工作條件，采用間接ELISA法檢測SLE、RA(Rheumatoid arthritis，RA)和健康人血清中CHSP60特異性IgG抗體水平和陽性率。
　　

4、4.分別運用GOR、nnPredict、HNN和SOPMA四種方法對CHSP60的二級結構進行預測，并對其跨膜區(qū)域、極性、親水性、柔韌性、表面可及性和抗原性等方面進行分析，同時將CHSP60的全長氨基酸序列與人HSP60的氨基酸序列進行同源性比對，預測出可能與SLE等自身免疫性疾病相關的CHSP60 B細胞優(yōu)勢表位。
　　5.將預測的B細胞表位氨基酸序列委托生物技術公司合成肽，肽經KLH偶聯(lián)劑藕聯(lián)后進行動物免疫，檢測各B細胞表位的

5、免疫原性。選擇4-6周雌性BALB/c小鼠，每組6只，用合成肽作為免疫原，分別于實驗的第1w、3w、5w、7w免疫，并以PBS和KLH作為對照組。于實驗的第0w、2w、4w、6w和8w，斷尾取血，采用間接ELISA方法檢測各B細胞表位的免疫原性。
　　6.用相應B細胞表位合成肽作為包被抗原，采用間接ELISA法進一步檢測SLE和健康人血清特異性IgG抗體水平以及陽性率。
　　結果:
　　1.經酶切鑒定和核苷酸測序表明，

6、成功構建了pET21a(+)/CHSP60重組質粒。
　　2.成功的在原核表達系統(tǒng)誘導出CHSP60融合蛋白，并經SDS-PAGE及Westernblot法鑒定在相對分子質量(Mr)約60000處出現特異性條帶。
　　3.BALB/c小鼠經CHSP60融合蛋白免疫后，血清中產生了特異性的抗CHSP60IgG抗體，且IgG抗體水平隨著免疫次數的增加而升高，至第8周達高峰，并與PBS組相比較具有顯著差異(P＜0.05)。

7、　　4.Western blot檢測顯示，CHSP60融合蛋白能被SLE患者血清識別。ELISA法檢測結果為:SLE組、RA組以及健康對照組血清CHSP60lgG抗體水平均值，分別為0.4±0.28，0.34±0.26和0.13±0.13，SLE和RA組抗體水平均高于健康對照組(P＜0.05），而SLE組和RA組抗體水平比較，無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05）。SLE組、RA組和健康對照組抗體陽性率分別為28.47％，19.19％3.45

8、％，SLE組陽性率明顯高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（X2=22.025，P＜0.05），RA組陽性率高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(X2=11.006，P＜0.05)，而SLE組和RA組陽性率比較，無統(tǒng)計學差異(X2=2.717，P＞0.05)。
　　5.4種方法預測CHSP60二級結構，結果顯示，二級結構中的柔性區(qū)域以無規(guī)卷曲為主，少見轉角。結合人HSP60氨基酸序列同源性比對后，預測出CHSP60氨基酸序列130-14

9、3，283-296，362-371，388-399，160-177區(qū)域段為優(yōu)勢B細胞表位區(qū)段。
　　6.5個B細胞表位合成肽免疫BALB/c小鼠后，經檢測僅有表位1(RKISKPVQHHKE)和表位2(DRRKAMLEDIAILT)組小鼠體內產生特異性IgG抗體，并至第8周達高峰，較PBS組和KLH組均有顯著差異（P＜0.05）。
　　7.5個B細胞表位合成肽ELISA法檢測SLE、RA和健康人血清中特異性IgG抗體。B細胞

10、表位合成肽1-5包被檢測結果為:SLE組抗體水平均值分別為0.58±0.21，0.64±0.26，0.57±0.27，0.42±0.21，0.48±0.23; RA組分別為0.56±0.24，0.35±0.22，0.37±0.17，0.48±0.20，0.43±0.24，健康對照組分別為0.24±0.15，0.31±0.14，0.23±0.14，0.18±0.12，0.35±0.09。其中表位1-4中，SLE組抗體水平分別與健康對照組比

11、較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）;表位1和4中RA組抗體水平均高于健康對照組，統(tǒng)計學差異顯著（P＜0.05）;表位2中SLE組抗體水平高于RA組，且具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。SLE組陽性率分別為29.16％，33.33％，27.78％，24.31％，27.08％，RA組陽性率分別為24.24％，14.14％，8％，21.21％，22.22％，而健康對照組的陽性率分別為2.3％，2.3％，2.3％，0，0.在表位1-5中，SLE組陽

12、性率均高于健康對照組，統(tǒng)計學差異顯著（P＜0.05）。在表位1，2，4，5中，RA組陽性率均高于健康對照組，統(tǒng)計學差異顯著(P＜0.05）。在表位2和3中，SLE組陽性率均高于RA組，統(tǒng)計學差異顯著（P＜0.05)。
　　結論:
　　1.獲得了具有良好的免疫原性和抗原性的CHSP60融合蛋白，為后續(xù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡血清特異性抗體檢測奠定了基礎。
　　2.獲得了2個具有良好免疫原性的CHSP60 B細胞表位，即細胞表位1(