Toll樣受體4(TLR4)拮抗劑在大鼠顱腦創(chuàng)傷中的作用及對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)元自噬調(diào)節(jié)的分子機(jī)制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷（Traumatic brain injury, TBI）是神經(jīng)外科中最常見的疾病，也是中青年人群（<45歲）中最具威脅的致殘、致死因素之一。TBI是以原發(fā)性損傷為基礎(chǔ)而逐漸發(fā)展起來以繼發(fā)性腦損傷為主的一系列復(fù)雜的分子級(jí)聯(lián)事件的總和，最終導(dǎo)致腦組織水腫，神經(jīng)元死亡，運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能受損的嚴(yán)重臨床疾病。在繼發(fā)性損害機(jī)制中包括，神經(jīng)炎癥反應(yīng)、自由基的堆積、鈣超載、線粒體功能障礙、細(xì)胞的凋亡等，然而證據(jù)表明 TBI后引發(fā)的無菌性神經(jīng)

2、炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元的過度自噬也作為加重腦損傷的重要因素，越來越多的受到研究者的關(guān)注。
　　TLR4是一類介導(dǎo)天然免疫的跨膜信號(hào)受體，通過與配體結(jié)合啟動(dòng)一系列分子級(jí)聯(lián)在神經(jīng)系統(tǒng)損害中參與神經(jīng)炎癥的調(diào)控。自噬是由溶酶體介導(dǎo)的一種降解途徑，主要降解細(xì)胞器內(nèi)受損及冗余成分的氨基酸，衰老的細(xì)胞器及胞內(nèi)病原體。近年來，自噬還被認(rèn)為是一種先天免疫的防御機(jī)制，而 TLR4可能擔(dān)任了一個(gè)至今未被我們發(fā)現(xiàn)的自噬發(fā)生的環(huán)境傳感器的作用。研究發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞

3、中，TLR4在識(shí)別配體-LPS后能夠觸發(fā)自噬反應(yīng)，而在TBI后自噬的過度激活是否與TLR4的激活相關(guān)；在給予TLR4抑制劑后能否減輕 TBI后神經(jīng)元自噬的程度以及 TLR4的下游信號(hào)分子MyD88、TRIF是否參與了神經(jīng)元自噬的調(diào)控，本課題將分三部分進(jìn)行闡述。
　　第一部分大鼠腦創(chuàng)傷后TLR4的表達(dá)變化及在繼發(fā)性腦損傷中的作用
　　目的：應(yīng)用電子控制性腦皮質(zhì)撞擊損傷（eCCI）方法復(fù)制SD雄性大鼠TBI模型，給予TLR4抑制

4、劑TAK-242干預(yù)，檢測海馬區(qū)TLR4的表達(dá)變化及在繼發(fā)性腦損傷中的作用。
　　方法：成年雄性SD大鼠96只數(shù)字隨機(jī)分四組：①假手術(shù)組（Sham group）；②腦創(chuàng)傷組（TBI group）；③腦創(chuàng)傷+溶劑組（DMSO group）；④腦創(chuàng)傷+TAK-242組（TAK-242 group）。采用eCCI方法復(fù)制TBI模型，取傷后6 h、12 h、24 h、48 h4個(gè)時(shí)間進(jìn)行檢測：①HE染色觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)改變；②免疫組化

5、檢測海馬區(qū)TLR4的表達(dá)、定位；③熒光定量PCR檢測海馬區(qū)TLR4 mRNA的表達(dá)；④Western-blot檢測海馬區(qū)TLR4蛋白的表達(dá)；⑤干濕比重法檢測腦組織水含量；⑥另取20只SD大鼠于TBI后8、9、10天進(jìn)行Morris水迷宮測試，檢測其空間學(xué)習(xí)記憶能力。應(yīng)用 Image Proplus6.0、Image J和Image Lab4.1軟件分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析測定，數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

6、。以P<0.05，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1 HE染色：Sham組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常，皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元排列整齊，細(xì)胞數(shù)量多且形態(tài)正常；TBI組和 DMSO組創(chuàng)傷灶及周邊組織明顯水腫，皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元胞體腫脹明顯，核仁皺縮濃染明顯，細(xì)胞間隙變大，血管擴(kuò)張明顯，出現(xiàn)神經(jīng)元變性及壞死；TAK-242治療組較TBI組和DMSO組相比，神經(jīng)元胞體腫脹緩解，核濃縮明顯減輕，神經(jīng)元周圍間隙明顯較?。? TLR4免疫組化結(jié)果：TLR

7、4在海馬區(qū)主要定位于神經(jīng)元細(xì)胞的胞膜。Sham組偶可見陽性細(xì)胞，著色淺淡；與 Sham組比較，TBI組和DMSO組，TLR4陽性細(xì)胞顯著增多，著色加深，免疫反應(yīng)性增強(qiáng)（P<0.05）；TAK-242治療組與TBI組和DMSO組相比， TLR4免疫反應(yīng)性明顯減弱（P<0.05）；3熒光定量PCR結(jié)果：與Sham組相比，TBI和DMSO組海馬區(qū)TLR4 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05）， TAK-242處理后，TLR4 mRNA表達(dá)明顯

8、降低（P<0.05）；4 Westernblot結(jié)果：Sham組TLR4的蛋白有少量表達(dá)，在各時(shí)間點(diǎn)均無明顯變化；TBI組和DMSO組TLR4的蛋白表達(dá)量在傷后6 h開始升高，于24 h達(dá)高峰，持續(xù)至傷后48 h，與Sham組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；TAK-242組各時(shí)間點(diǎn)TLR4蛋白表達(dá)趨勢與TBI和DMSO組相似，但是其蛋白表達(dá)量明顯降低（P<0.05）；5腦組織水含量：Sham組各時(shí)間點(diǎn)腦組織水含量未見差異；DMSO組

9、各時(shí)間點(diǎn)含水量與TBI組相似，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但均明顯高于Sham組（P<0.05)；TAK-242組各時(shí)間點(diǎn)水含量較TBI組明顯減少（P<0.05）；6 Morris水迷宮結(jié)果：于TBI后第8-10天對(duì)各組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測試。TBI組和DMSO組傷后第8-10天搜索安全島平均潛伏期較Sham組均明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；TAK-242組傷后第8-10天搜索安全島運(yùn)動(dòng)軌跡、潛伏期均較TBI和D

10、MSO組明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　小結(jié)：應(yīng)用eCCI方法成功建立了大鼠局灶性TBI模型；大鼠TBI后海馬區(qū)TLR4表達(dá)上調(diào)，加重TBI后繼發(fā)性腦損傷；給予TAK-242進(jìn)行干預(yù)后，可以降低TLR4的激活，減輕腦組織含水量，改善TBI后大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能，具有一定神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分大鼠腦創(chuàng)傷后TLR4拮抗劑對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)元自噬的影響
　　目的：探討大鼠TBI后海馬區(qū)神經(jīng)元自噬的激活以及TL

11、R4是否調(diào)控了海馬區(qū)神經(jīng)元自噬的表達(dá)。
　　方法：TBI模型同上，95只雄性 SD大鼠隨機(jī)分四組。①假手術(shù)組（Sham group）；②腦創(chuàng)傷組（TBI group）；③腦創(chuàng)傷+3-MA組（3-MA group）；④腦創(chuàng)傷+TAK-242組（TAK-242 group）。取傷后6 h、12 h、24 h、48 h4個(gè)時(shí)間對(duì)下列指標(biāo)進(jìn)行檢測：①透射電鏡觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，檢測自噬體；②免疫組化檢測海馬區(qū) LC3、Becl

12、in1的表達(dá)、定位；③Western-blot檢測海馬區(qū)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1蛋白的表達(dá)；④熒光雙標(biāo)檢測海馬區(qū)LC3和神經(jīng)元標(biāo)記NeuN的表達(dá)、定位。定量分析和統(tǒng)計(jì)方法同第一部分。
　　結(jié)果：1透射電鏡結(jié)果：在TBI后24 h，神經(jīng)元胞核周圍有大量損傷后腫脹及變性的線粒體，并可見到雙層膜樣結(jié)構(gòu)環(huán)繞受損線粒體后形成的自噬小體；2 LC3、Beclin1免疫組化結(jié)果：LC3主要定位于海馬區(qū)神經(jīng)元的胞質(zhì)中，Sham組可見少量

13、陽性細(xì)胞，著色淺淡；與Sham組比較， TBI組于傷后6 h可見陽性細(xì)胞顯著增多，著色加深，免疫反應(yīng)性增強(qiáng)，傷后24 h達(dá)高峰，48 h略有下降，但仍顯著高于Sham組（P<0.05）；3-MA組和TAK-242組與TBI組比較，LC3陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，著色變淺，免疫陽性反應(yīng)性明顯減弱（P<0.05）。Beclin1也主要定位于海馬區(qū)神經(jīng)元的胞質(zhì)中，Sham組偶見陽性細(xì)胞，著色淺淡；與Sham組比較， TBI組于傷后6 h可見陽性細(xì)胞

14、明顯增多，著色加深，免疫反應(yīng)性增強(qiáng)，至48仍維持在強(qiáng)表達(dá)水平（P<0.05）；與TBI組相比較，3-MA組和TAK-242組各時(shí)間點(diǎn)陽性表達(dá)與免疫反應(yīng)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；3 LC3的Westernblot結(jié)果：Sham組LC3II/LC3I的比值在各時(shí)間點(diǎn)無明顯變化；與Sham組比較，TBI組LC3II/LC3I的比值隨著傷后時(shí)間的推移，逐漸增高，高表達(dá)狀態(tài)持續(xù)至傷后48 h（P<0.05）；3-MA組和TAK-

15、242組LC3II/LC3I的比值較TBI組在傷后各時(shí)間點(diǎn)均明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；4 Beclin1的Westernblot結(jié)果：Sham組Beclin1的蛋白表達(dá)較低，在各時(shí)間點(diǎn)無明顯變化；與Sham組比較，TBI組Beclin1的蛋白表達(dá)于傷后6 h出現(xiàn)顯著增高，傷后24 h達(dá)高峰，48 h略有下降，但仍顯著高于Sham組（P<0.05）；與TBI組相比較，3-MA組和TAK-242組Beclin1蛋白表達(dá)在各時(shí)間

16、點(diǎn)均明顯減少（P<0.05）；5海馬區(qū)LC3與神經(jīng)元標(biāo)記NeuN熒光雙標(biāo)檢測結(jié)果：TBI組24 h可見海馬CA1區(qū)大量紅色熒光（LC3）與綠色熒光（NeuN）重疊呈橘黃色聚集，表明該區(qū)神經(jīng)元發(fā)生了自噬；3-MA組和TAK-242組24 h顯示標(biāo)記LC3的紅色熒光明顯較弱，與TBI組相比，Merged后的熒光重疊明顯減少，表明神經(jīng)元自噬水平的下降。
　　小結(jié)：大鼠TBI后于6-48 h可檢測到海馬區(qū)神經(jīng)元自噬現(xiàn)象的發(fā)生，應(yīng)用TAK-

17、242能夠和自噬抑制劑3-MA發(fā)揮同樣的效果，即明顯抑制了TBI后海馬區(qū)神經(jīng)元自噬的發(fā)生程度，因此TBI后TLR4可能通過某種途徑介導(dǎo)了海馬區(qū)神經(jīng)元自噬的發(fā)生。
　　第三部分大鼠腦創(chuàng)傷后TLR4介導(dǎo)MyD88/TRIF通路在海馬區(qū)神經(jīng)元自噬調(diào)節(jié)的分子機(jī)制研究
　　目的：通過使用 MyD88路經(jīng)抑制劑 MIP和 TRIF路經(jīng)抑制劑Resveratrol進(jìn)行干預(yù)處理，明確TBI后TLR4介導(dǎo)的MyD88或TRIF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否

18、參與了調(diào)節(jié)海馬區(qū)神經(jīng)元自噬的發(fā)生。
　　方法：TBI模型同上，將85只SD大鼠隨機(jī)分五組。①假手術(shù)組（Sham group）；②腦創(chuàng)傷組（TBI group）；③腦創(chuàng)傷+TAK-242組（TAK-242 group）；④腦創(chuàng)傷+ MIP組（MIP group）；⑤腦創(chuàng)傷+ Resveratrol組（RV group）。取傷后12 h、24 h、48 h3個(gè)時(shí)間對(duì)下列指標(biāo)進(jìn)行檢測：①免疫組化檢測海馬區(qū)MyD88、TRIF的表達(dá)、定位

19、；②Westernblot檢測海馬區(qū) TLR4、MyD88、TRIF、Beclin1蛋白的表達(dá)；③熒光雙標(biāo)檢測海馬區(qū)TLR4、Beclin1分別和神經(jīng)元標(biāo)記NeuN的雙標(biāo)定位。定量分析和統(tǒng)計(jì)方法同第一部分。
　　結(jié)果：1 MyD88、TRIF免疫組化結(jié)果：MyD88主要定位于海馬區(qū)神經(jīng)元的胞漿，Sham組可見少量MyD88陽性細(xì)胞，呈淡黃色；與Sham組比較，TBI組于傷后12 h可見陽性細(xì)胞顯著增多，呈棕黃色，持續(xù)陽性表達(dá)至48

20、 h（P<0.05）；與TBI組比較，TAK-242組和MIP組中MyD88陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，免疫陽性反應(yīng)性明顯減弱（P<0.05）；RV組中， MyD88免疫反應(yīng)性與TBI組一致，兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。TRIF陽性表達(dá)也定位于海馬區(qū)神經(jīng)元的胞漿，Sham組偶可見陽性細(xì)胞，免疫陽性反應(yīng)不隨時(shí)間發(fā)生變化；與Sham組比較，TBI組中各時(shí)間點(diǎn)均可見大量TRIF陽性細(xì)胞，著色加深，免疫反應(yīng)性顯著增強(qiáng)（P<0.05）。TAK-2

21、42組和MIP組結(jié)果與TBI組一致，三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。RV組與Sham相似，與TBI組比較，TRIF陽性細(xì)胞顯著減少，著色淺淡，免疫反應(yīng)性顯著減弱（P<0.05）；2 TLR4的Westernblot結(jié)果：Sham組TLR4的蛋白表達(dá)較低，在各時(shí)間點(diǎn)無明顯變化；與 Sham組比較，TBI組TLR4蛋白顯著增高，高表達(dá)狀態(tài)持續(xù)至傷后48 h（P<0.05）；與TBI組相比較，TAK-242組TLR4蛋白表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均顯

22、著降低（P<0.05）；在MIP組和RV組，TLR4蛋白表達(dá)與TBI組一致，各時(shí)間點(diǎn)均呈高表達(dá)狀態(tài)；3 MyD88的Westernblot結(jié)果：Sham組MyD88蛋白表達(dá)量較低，在各時(shí)間點(diǎn)無明顯變化；與Sham組比較，TBI組在各時(shí)間點(diǎn)MyD88蛋白表達(dá)均顯著增高（P<0.05）；與TBI組相比較，TAK-242組和MIP組中MyD88蛋白表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著降低（P<0.05）；RV組MyD88蛋白表達(dá)與TBI組一致；4 TRIF的

23、Westernblot結(jié)果：Sham組TRIF蛋白表達(dá)量較低，在各時(shí)間點(diǎn)無明顯變化；與Sham組比較，TBI組、TAK-242組和MIP組中在各時(shí)間均出現(xiàn)TRIF蛋白的高表達(dá)（P<0.05），三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。RV組TRIF蛋白表達(dá)與Sham組相似；5 Beclin1的Westernblot結(jié)果：Sham組Beclin1蛋白表達(dá)相對(duì)較低，在各時(shí)間點(diǎn)無明顯變化；與Sham組比較，TBI組于傷后12 h出現(xiàn)Beclin1蛋

24、白量表達(dá)增高，持續(xù)至48 h，在各時(shí)間點(diǎn)均顯著增高（P<0.05）；與TBI組相比較，TAK-242組和MIP組Beclin1蛋白表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均明顯減少（P<0.05），兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；RV組Beclin1蛋白表達(dá)與TBI組一致；6海馬區(qū) TLR4與神經(jīng)元標(biāo)記 NeuN熒光雙標(biāo)檢測結(jié)果：TLR4為DyLight594標(biāo)記的細(xì)胞胞膜紅色熒光，NeuN為DyLight488標(biāo)記的細(xì)胞胞漿綠色熒光，TBI組24 h可見海

25、馬CA1區(qū)大量紅色熒光與綠色熒光重疊呈橘黃色聚集；TAK-242組Merged后的熒光重疊明顯減少；7海馬區(qū)Beclin1與神經(jīng)元標(biāo)記NeuN熒光雙標(biāo)檢測結(jié)果：Beclin1為DyLight594標(biāo)記的細(xì)胞胞漿紅色熒光，NeuN為DyLight488標(biāo)記的細(xì)胞胞核周綠色熒光；TBI后24 h可見海馬CA1區(qū)Beclin1紅色熒光明顯增強(qiáng)，Merged后重疊呈橘黃色聚集；TAK-242組和MIP組，Beclin1紅色熒光強(qiáng)度明顯降低，Me

26、rged后重疊明顯減少；RV組與TBI相似，Merged后可見橘黃色重疊聚集（Fig.9-4），表明TAK-242和MIP均可抑制自噬發(fā)生的程度。
　　小結(jié)：大鼠TBI后TLR4介導(dǎo)的MyD88和TRIF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均被激活，共同參與了繼發(fā)性腦損害發(fā)生；而 TAK-242通過TLR4/MyD88/Beclin1信號(hào)通路降低了TBI后海馬區(qū)神經(jīng)元的自噬。
　　結(jié)論：大鼠顱腦創(chuàng)傷后，TLR4的激活加重了繼發(fā)性腦損傷，TAK-24