兔出血癥病毒(RHDV)與兔出血癥病毒2型(RHDV2)的RT-PCR檢測方法研究.pdf

1、兔病毒性出血癥(rabbit hemorrhagic disease，RHD)，俗稱兔瘟，是由兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的兔的一種急性、高度致死性傳染病。RHD以呼吸系統(tǒng)出血，實質器官淤血、腫大、出血和肝臟壞死為主要病變特征，主要危害2月齡以上的養(yǎng)殖和野生的多個穴兔品種，死亡率達80％-100％。RHD于1984年被我國首次報道后，在世界很多國家出現(xiàn)發(fā)病和流行的報道，嚴

2、重威脅著世界養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展，被國際動物衛(wèi)生組織列為法定通過動物疫病。2010年在法國出現(xiàn)了由RHDV新種即兔出血癥病毒2型(rabbit hemorrhagic disease virus2，RHDV2)引起的能感染致死30日齡以內的兔子和傳統(tǒng)RHDV毒株滅活苗的免疫過的兔子的新型兔病毒性出血癥(new rabbit hemorrhagic disease，nRHD)，也稱為兔病毒性出血癥2型(rabbit hemorrhagic d

3、isease type2，RHD2)。近年來RHD2已擴散至意大利、西班牙、德國、葡萄牙、英國、挪威等多數(shù)西歐國家和亞速爾群島等國。我國目前尚無該病發(fā)生及其相關的研究報道，為此本研究在對RHDV2和RHDV基因序列分析基礎上對其RT-PCR檢測技術進行了初步研究，具體如下:
　　為建立用于兔出血癥病毒2型(RHDV2)的快速檢測方法。根據GenBank已公布的RHDV和RHDV2 VP60基因，設計合成2對特異性引物和10條搭橋引

4、物，通過搭橋PCR人工合成RHDV2 VP60基因中保守區(qū)片段，構建重組質粒，并以其為模板，經過反應條件優(yōu)化、敏感性試驗、特異性試驗和35份樣品檢測應用，初步建立RHDV2 RT-PCR檢測方法。結果表明成功合成RHDV2 VP60基因的435 bp保守片段和構建了pMD-19T-RHDV2重組質粒以及pMD-19T-RHDV441，初步建立的RHDV2RT-PCR方法具有良好的特異性和敏感性，RHDV2的檢測限度可達到230個拷貝的靶

5、基因片段，檢測RHDV、pGM-T-EBHSV（已構建）、兔源巴氏桿菌、兔源大腸桿菌和兔源沙門氏菌均無特異性擴增。樣品檢測結果顯示樣品中RHDV2核酸陰性。為建立用于兔出血癥病毒（RHDV）與兔出血癥病毒2型（RHDV2）鑒別診斷的檢測方法，根據GenBank已公布的RHDV和RHDV2的VP60基因，在上面研究的基礎上又設計合成1對特異性引物，采用RT-PCR和搭橋PCR技術分別獲取RHDV和RHDV2的VP60基因中保守區(qū)片段，構建

6、重組質粒pMD-19T-RHDV2、pMD-19T-RHDV441（上面已構建）和pMD-19T-RHDV294，并以其為模板，經過反應條件優(yōu)化、敏感性試驗、特異性試驗，以及人工感染RHDV樣品和臨床樣品的應用，對RHDV與RHDV2的復合RT-PCR檢測方法進行了初步研究。結果顯示建立的RHDV與RHDV2復合RT-PCR方法具有良好的特異性和敏感性，可分別擴增出RHDV和RHDV2的VP60保守區(qū)基因片段大小為294 bp和435

7、bp，RHDV與RHDV2的檢測限度分別為160和230個拷貝的靶基因片段，而pGM-T-EBHSV（已構建）、兔源巴氏桿菌、兔源大腸桿菌和兔源沙門氏菌等病原的檢測結果均為陰性。樣品檢測結果顯示人工感染樣品的RHDV檢出率為100％(5/5)，30份臨床檢樣RHDV和RHDV2檢測結果均為陰性。
　　本研究為我國進行RHDV2的防控提供了一種技術儲備和奠定了基礎，同時為RHDV和RHDV2的鑒別與流行病學調查提供了科學方法和科學參