幼兔病毒性出血癥免疫失敗原因及防制措施的研究.pdf

1、兔出血癥是家兔的一種烈性傳染病，以發(fā)病急、傳播速度快、死亡率高為特點，并主要感染3月齡以上成年兔，曾給養(yǎng)兔業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。幾年以前，通過疫苗注射可較好地控制本病。但是近年來，3月齡以下、甚至2月齡以下幼兔時有發(fā)病，給該病的防控提出了新問題。究竟是抗原變異的原因還是免疫程序的問題需要進一步研究。本研究首先對華東三省RHD的病原進行了分子流行病學調查，對三個分離毒株的基因序列、致病性和免疫原性進行了比較，研究了幼兔出血癥的免疫程序，并

2、探討了中藥佐劑對疫苗的免疫增強作用和作用機理。本研究的目的，旨在尋找理想的免疫程序和疫苗佐劑，為幼兔出血癥的防控提供理論依據(jù)。具體內容為以下六個部分： 試驗I、華東三省RHDV的分子流行病學調查 為了弄清兔出血癥病毒的流行規(guī)律，從2005年到2007年對山東、江蘇、安徽三個養(yǎng)兔大省的家兔的帶毒情況進行了調查。首先建立了RHDV RT-PCR檢測方法，按照GenBank上公布的RHDV基因序列設計一對引物，以RHDV發(fā)病兔

3、的新鮮兔肝為材料，提取總RNA，進行cDNA的合成和PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行克隆測序，擴增出與預期的269bp大小一致的片段，該產(chǎn)物序列與公布的RHDV基因序列有95.8％～98.5％的同源性。然后對RT-PCR方法的敏感性、特異性和RHDV的臟器分布進行試驗．結果表明，RT-PCR方法的敏感性是HA的1×104倍，對RHD發(fā)病死亡兔，能從除糞便以外的各種臟器中檢測到病毒。運用建立的RT-PCR方法對采集的不同日齡段的兔鼻拭樣品和出入

4、境兔肉產(chǎn)品進行檢測，同時選擇數(shù)個分離毒株進行測序和序列比較。結果，400份出入境兔肉產(chǎn)品中沒有發(fā)現(xiàn)陽性樣品，512份鼻拭子中有48份陽性樣品，表明兔出血癥病毒在華東三省廣泛存在，不同日齡段兔之間的帶毒率存在顯著性差異；而不同年份、不同省份兔之間帶毒率差異不顯著；序列比較結果發(fā)現(xiàn)三株不同序列，其與Genbank上已公布序列的同源性為93.7％～99.6％。 試驗II、幼兔RHDV三個分離株的基因序列、致病性和免疫原性比較

5、為了研究幼兔RHDV與疫苗株RHDV的區(qū)別，應用RT-PCR技術對幼兔RHDV的3個分離株(HN、SH、DY株)和疫苗對照FY株進行RT-PCR擴增，同時進行VP60序列測定、序列比對和蛋白質同源性分析；用4個毒株對兔只進行攻毒，記錄死亡時間和死亡率，比較致病性差異；用4個毒株制成疫苗，免疫家兔，比較其免疫原性。結果，3個分離株的基因序列同源性為95.2％～97.4％，氨基酸同源性為95.8％～99.3％；4個毒株的致死率、致病病程和病

6、毒血凝性沒有顯著性差異；4個疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體為同一血清型，各個疫苗均可以抵抗其它毒株的攻擊，表明幼兔RHDV的3個分離株與疫苗株之間的免疫原性無顯著差異。 試驗III、免疫日齡對兔病毒性出血癥抗體水平產(chǎn)生的影響 試驗1通過攻毒實驗比較了新西蘭家兔0、1、2、3和4log2 5種抗體水平對的病毒性出血癥(RHD)的保護效果，結果表明，抗體效價高于3 log2時可產(chǎn)生100％的保護，2 log2的保護率僅為50％。

7、 試驗2測定了30、35、40、45、50、55和60日齡非免疫兔的母源抗體效價和用RHD組織滅活苗免疫后8周內血清抗體效價的動態(tài)變化，結果發(fā)現(xiàn)，母源抗體與日齡呈負相關，在30日齡時最高，可以產(chǎn)生有效的保護，在40日齡后已無保護作用；免疫日齡與抗體峰值和有效保護時間呈正相關，30日齡免疫，抗體效價不但不升、反而顯著下降，無保護作用；35日齡免疫，抗體峰值較低，有效保護時間僅為2周；大于40日齡免疫，抗體峰值較高，有效保護時間延長。

8、 試驗IV、幼兔出血癥免疫程序的研究 試驗1選擇35、40、45三種日齡新西蘭家兔各30只，每個日齡兔隨機均分為5組，對照組注射生理鹽水，4個試驗組分別注射4種劑量(1mL、2mL、3mL、4mL)的兔病毒性出血癥疫苗，對照組注射生理鹽水，分別于免疫前及免疫后1～7周內采血測定血清抗體效價的動態(tài)變化。結果表明，各日齡兔的2mL、3 mL、4 mL劑量組的抗體上升速度和有效抗體維持時間均顯著大于同日齡的1 mL劑量組；35日齡

9、兔的2 mL、3 mL、4 mL劑量組的抗體峰值顯著高于1 mL劑量組。35日齡一次性注射疫苗2mL，其抗體效價在多數(shù)時間點顯著高于二次注射1mL疫苗的抗體效價。 試驗2比較兩種免疫程序的免疫效果，結果表明，1次性免疫2mL組的抗體水平在大多數(shù)時間點顯著高于兩次免疫1mL組。以上結果提示35日齡免疫、注射劑量2 mL為最佳免疫程序。 試驗V、中藥佐劑對RHD疫苗的免疫增強作用 為了增強兔出血癥疫苗的免疫效果，選擇

10、4中藥成分(黃芪多糖，淫羊藿多糖，蜂膠黃酮，人參皂甙)組成2個復方，分別與兔出血癥疫苗混合后免疫幼兔，以鋁膠苗和無佐劑苗為對照，分別于免疫后7、14、21、28、35、49天采血，用微量血凝法測定血清抗體的動態(tài)變化，用MTT法測定外周血T、B淋巴細胞轉化的動態(tài)變化；于免疫后63天測定免疫器官指數(shù)并進行攻毒試驗。結果表明，復方1在部分時間點能顯著提高血清抗體效價，復方2在多數(shù)時間點能顯著提高血清抗體效價；兩個復方在第7天顯著促進T淋巴細胞

11、轉化，在第7～21天顯著促進B淋巴細胞轉化；兩個復方顯著增大圓小囊、腸淋巴結器官指數(shù)，提高保護率。 試驗VI、中藥佐劑對淋巴細胞的轉化及其IFN-γ、IL-10 mRNA表達的影響 為了進一步證實兩個中藥成分復方佐劑的免疫增強作用，并探討其作用機理，比較了兩個復方對培養(yǎng)的兔外周血淋巴細胞增殖的作用，運用熒光定量RT-PCR方法比較了兩個復方對兔外周血淋巴細胞IFN-γ、IL-10 mRNA表達的影響。結果表明，兩個中藥成