QX型傳染性支氣管炎病毒疫苗株雞胚傳代致弱分子機制的初步研究.pdf

1、傳染性支氣管炎(infectious bronchitis，IB)是由傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitisvirus，IBV)引起的急性、高度接觸性傳染病。由于IBV的易變性，不同地區(qū)、不同時期流行的IBV毒株差異很大。自1996年QX型IBV在我國首次分離以來，即表現(xiàn)出較強的傳播能力，在許多國家和地區(qū)流行，目前已成為我國IBV流行株的優(yōu)勢基因型。由于不同類型IBV毒株之間只有部分或完全沒有交叉保護作用，而我國

2、目前廣泛使用的Mass型疫苗與QX型毒株親緣關系較遠，這就導致疫苗免疫失敗的情況時常發(fā)生，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。因此，研制與當前流行毒株抗原性一致的疫苗對于IB的防控顯得尤為重要。本實驗室前期曾對QX型IBV CK/CH/JS/2010/12株進行了雞胚連續(xù)傳代致弱，并獲得了免疫原性好、遺傳性狀穩(wěn)定的弱毒疫苗株（QXL株）。在臨床試驗中，QXL株的安全性和免疫保護效果良好。本研究對QXL株的第5代、第40代、第60代、第80代和第

3、100代毒株(QXL-5、QXL-40、QXL-60、QXL-80、QXL-100)進行了全基因測序，并構(gòu)建了QXL-5毒株的反向遺傳系統(tǒng)，為了解QX型IBV CK/CH/JS/2010/12株雞胚傳代致弱的分子機制提供了依據(jù)。
　　1.不同代次IBV CK/CH/JS/2010/12株的全基因序列測定與分析
　　對IBV QXL-5、QXL-40、QXL-60、QXL-80、QXL-I00的全基因進行分段克隆、測序，并通過

4、生物學軟件對各片段比對、拼接，獲得各代次毒株的全基因序列。結(jié)果顯示，QXL株基因組結(jié)構(gòu)為5'UTR-1a-1b-S-3a-3b-M-ORFX-5a-5b-N-UTR3'。其中QXL-5和QXL-40全長為27681bp，QXL-60、QXL-80和QXL-100全長為27682bp，其基因組在ORFX處多出一個堿基A。對各代次毒株的全基因序列分析發(fā)現(xiàn)， QXL-40、QXL-60基因序列變化較大，分別占堿基總變化數(shù)的28.21％和66.

5、67％，而QXL-80、QXL-100基因序列與QXL-60相比，變化很少，趨于穩(wěn)定。與前期動物試驗結(jié)果保持一致。在傳代過程中，QXL-40有44個堿基發(fā)生變化，并引起23個氨基酸變化;QXL-60在此基礎上又有108個堿基發(fā)生變化，并引起31個氨基酸變化;QXL-80在前面148處變化的基礎上又有2個堿基發(fā)生變化，引起2個氨基酸變化;QXL-100在前面150處變化的基礎上又有6個堿基發(fā)生變化，并引起3個氨基酸變化。這些突變的氨基酸分

6、散地存在于基因組的不同區(qū)域，其中nsp2變化最大，nsp3和S基因也發(fā)生了較大的變化。分析結(jié)果表明IBV的毒力強弱可能不是由單個氨基酸的突變引起的，而是由多個基因共同決定的;同時，其非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)在病毒毒力變化中可能發(fā)揮重要作用。
　　2.IBVQXL-5株反向遺傳平臺的建立
　　為了進一步研究IBV的變異機理，我們將QXL-5的全基因分成13段進行感染性克隆的構(gòu)建。通過引物在其5'末端引入T7 RNA聚合酶啟動子核心序列，3

7、'末端加上polyA尾巴結(jié)構(gòu)，并在ORF5引入一同義突變作為遺傳標記。首先將各片段連入pEASY-Blunt載體中進行克隆、測序。然后各測序正確的片段經(jīng)酶切、體外拼接獲得基因組全長cDNA分子。同時獲得N基因全長cDNA以提高病毒的拯救效率。最后經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、共轉(zhuǎn)染宿主細胞的方法獲得具有感染性的病毒。轉(zhuǎn)染后48h，將細胞反復凍融3次接種10日齡SPF雞胚，并盲傳數(shù)代。對親本毒株QXL-5及盲傳3代的病毒進行EID50的測定。結(jié)果顯示兩者的