雙單倍體牙鲆純合不育個體的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、牙鲆（Paralichthys olivaceus）個體大、生長速度快、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，被視為名貴的海產(chǎn)養(yǎng)殖魚類，深受我國廣大消費(fèi)者的喜愛，市場銷售前景廣闊。牙鲆雌性生長速度快于雄性，養(yǎng)殖全雌牙鲆對提高其生長速度、縮短養(yǎng)殖周期和提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。利用有絲分裂雌核發(fā)育技術(shù)不僅能夠生產(chǎn)全雌魚，還能夠生產(chǎn)基因完全純合的個體，即雙單倍體(DH)，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行一代雌核發(fā)育可以生產(chǎn)基因型完全一致的純合克隆系，這對雌核發(fā)育育種的理論研究

2、和實(shí)際應(yīng)用均具有重要意義。但存在的問題是DH魚誘導(dǎo)困難，繁殖力低，極大的影響了DH和克隆魚的進(jìn)一步應(yīng)用。目前關(guān)于DH魚的繁殖問題開展的研究工作較少，僅有的少量研究主要集中在繁殖能力的表型描述上，具體的不育機(jī)制尚不清楚。因此，本研究通過減數(shù)分裂雌核發(fā)育提高牙鲆純合度后，以此為親本誘導(dǎo)DH，探討提高DH誘導(dǎo)效率的可行性;同時以同齡性腺正常發(fā)育的牙鲆為對照，對DH牙鲆的促性腺激素和性類固醇激素含量進(jìn)行了測定，以期從內(nèi)分泌學(xué)角度揭示DH牙鲆性腺

3、發(fā)育異常的原因;在此基礎(chǔ)上對同一家系可育和不育牙鲆的性腺進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的比較，篩選了可育和不育性腺的差異表達(dá)蛋白和基因，探討引起DH純合不育的分子機(jī)制，并為尋找其中起關(guān)鍵作用的蛋白和基因并研究其功能提供有用的信息。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)利用普通牙鲆親魚6尾（記為C1、C2、C3、C4、C5、C6）和減數(shù)分裂雌核發(fā)育組牙鲆6尾（記為G1、G2、G3、G4、G5、G6）進(jìn)行DH誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，探討親魚純合度與DH誘導(dǎo)率的

4、關(guān)系。結(jié)果表明，雌核發(fā)育組的純合度極顯著高于普通組（P＜0.01），雌核發(fā)育組平均純合度為0.70，而普通組親魚的平均純合度僅為0.43。有5尾普通親魚（G2-G6）誘導(dǎo)的后代在開口前全部死亡，對剩余7尾親魚的后代在生長至20日齡時各取30尾仔魚進(jìn)行后代純合性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有2尾雌核發(fā)育親魚的后代中出現(xiàn)了雜合個體，而在普通親魚后代中并未出現(xiàn)，推測后代中是否出現(xiàn)雜合子與親本的純合度并無直接無關(guān)。從誘導(dǎo)率上來看，無論是折算孵化率還是折算正常率，

5、雌核發(fā)育組均要顯著高于普通牙鲆組。通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，親本純合度與折算孵化率的Pearson相關(guān)性密切，其相關(guān)系數(shù)為0.920，達(dá)到極顯著水平(P＜0.01);親本純合度與折算正常率的Pearson相關(guān)性密切，其相關(guān)系數(shù)為0.925，達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。另外，本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)了C1和G3的減數(shù)分裂雌核發(fā)育，其誘導(dǎo)率和正常率均高于有絲分裂雌核發(fā)育。
　　(2)以2009年在北戴河中心實(shí)驗(yàn)站培育的DH牙鲆為材料，以同齡的兩性受精牙

6、鲆為對照，在1月、3月和5月進(jìn)行尾部采血，采用酶聯(lián)免疫方法測定和比較了血清雌二醇(E2)、睪酮(T)、促黃體生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)和17α，20β-雙羥孕酮(17α，20β-DHP)的含量，同時在5月份取性腺進(jìn)行切片觀察發(fā)育情況，以期從內(nèi)分泌學(xué)角度揭示DH牙鲆性腺發(fā)育異常的原因。結(jié)果表明，DH組牙鲆性腺體積小，性腺成熟系數(shù)低，僅為4.0％，卵母細(xì)胞多為不規(guī)則的多角形，以Ⅱ期和Ⅲ期為主，外部只有一層濾泡細(xì)胞。而對照組牙鲆性

7、腺體積大，性腺成熟系數(shù)極顯著高于DH牙鲆，達(dá)到了10.1％，細(xì)胞核膜消失并開始向動物極遷移，此時卵巢內(nèi)以成熟的Ⅳ期和Ⅴ期卵母細(xì)胞為主。激素水平上來看，在1月和3月份時，各激素含量與對照組牙鲆均未出現(xiàn)顯著性差異，而5月份各激素含量均出現(xiàn)了顯著性變化，其中DH不育牙鲆的E2含量顯著低于對照組，同時LH和FSH的含量也要顯著低于對照組，T和17α，20β-DHP含量DH組卻顯著高于對照組，推測不育個體的T轉(zhuǎn)化為E2和E2與17α，20β-DH

8、P途徑轉(zhuǎn)換過程中出現(xiàn)了異常。
　　(3)以選取同一DH家系中3條能夠正常產(chǎn)卵的DH牙鲆為對照，3條無法正常產(chǎn)卵的DH牙鲆為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)學(xué)研究。通過雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對可育和不育的蛋白質(zhì)組結(jié)果進(jìn)行比較，共發(fā)現(xiàn)了42個差異顯著的蛋白，其中不育組中高表達(dá)蛋白11個，可育組中高表達(dá)蛋白31個。31個可育組高表達(dá)蛋白當(dāng)中有2個蛋白只在可育組中表達(dá)，不育組中未見表達(dá)。差異蛋白中Vtg在不育組中的含量要顯著低于可育組，這與組織切

9、片中觀察到的不育組卵母細(xì)胞發(fā)育過程中卵黃積累不足相一致，暗示不育組性腺發(fā)育停止與Vtg的含量較低有關(guān)。性類固醇調(diào)控相關(guān)的2個蛋白，核基質(zhì)結(jié)合因子2(SAFB2)和膽固醇側(cè)鏈內(nèi)切酶(P450SCC)也在不育組中低量表達(dá)，尤其是SAFB2在不育組中未見表達(dá)，會對不育DH牙鲆的性類固醇生成途徑產(chǎn)生影響。此外，3個和鈣離子平衡相關(guān)的蛋白在不育組中的表達(dá)同樣低于可育組，分別為NUCB1、EFCAB3和EFCAB4B蛋白，推測這3個蛋白通過調(diào)控鈣離

10、子的平衡來影響牙鲆的性腺發(fā)育。
　　(4)采用RNA-Seq技術(shù)研究了同一家系可育DH牙鲆和不育DH牙鲆性腺組織的轉(zhuǎn)錄組，并對差異表達(dá)基因進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用CAP3軟件聚集全部轉(zhuǎn)錄樣本的裝配結(jié)果，獲得的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果包括了52474個contigs和N50長度是2895bp;應(yīng)用BWA軟件將cleanreads定位到All-Unigene，定位率可以達(dá)到99％，說明裝配質(zhì)量良好;獲得的unigenes中有31831條能夠比對到斑

11、馬魚上，通過GO注釋可以發(fā)現(xiàn)，有29416條unigenes注釋到了生物學(xué)進(jìn)程，29475條unigenes注釋到了分子功能，29464條unigenes注釋到了細(xì)胞組分。對可育組和不育組表達(dá)差異的unigene進(jìn)行篩選，得到差異表達(dá)unigenes1225個，包括492個上調(diào)unigenes和733個下調(diào)unigenes。1225條unigenes當(dāng)中有573個基因被注釋，其中351個參與了生物學(xué)進(jìn)程，63個處于細(xì)胞位置和128個具有

12、分子功能(P＜0.01)。顯著上調(diào)基因主要參與了甾醇代謝進(jìn)程、類固醇生物合成進(jìn)程和C21類固醇生物學(xué)合成等進(jìn)程，在這些進(jìn)程中主要是CYP11A1，CYP11B2，CYP17A1，CYP21A1，HSD3β和PRLR這6個基因高量表達(dá)。顯著的下調(diào)基因主要參與了免疫反應(yīng)、維生素D代謝進(jìn)程、抗原加工、血紅蛋白輸入、腎吸收、轉(zhuǎn)胞吞作用、脂肪蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白質(zhì)水解作用等進(jìn)程。通過KEGG數(shù)據(jù)對差異顯著基因進(jìn)行Pathway分析，利用fish exa

13、ct rest檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)62個pathways具有顯著性，包括26個顯著上調(diào)的pathways和36個顯著下調(diào)的pathways。最顯著的pathway是類固醇生物合成途徑，主要被4個基因影響，分別是CYP11A1，CYP11B2，CYP17A1和CYP21A1。另外一個重要的途徑是卵巢類固醇生成途徑，其它重要的途徑包括金黃色釀膿葡萄球菌感染、自身免疫甲狀腺疾病、造血細(xì)胞系、蛋白消化和吸收等主要受下調(diào)基因影響。
　　綜合上述，本研究

14、得到以下結(jié)論:親魚的純合度越高，DH的孵化率越高，孵化出的個體畸形率越低，利用減數(shù)分裂雌核發(fā)育提高后代的純合度，再進(jìn)行誘導(dǎo)DH，可以提高DH牙鲆的誘導(dǎo)效率。通過對可育牙鲆和不育牙鲆的蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析可以看出，一些調(diào)控性固醇激素合成進(jìn)程中的重要基因和蛋白，如CYP11A1、CYP11B2、CYP17A1、CYP21A1、SAFB2等均在不育牙鲆中低量表達(dá)，而且通過激素水平測定也發(fā)現(xiàn)，LH、FSH和E2在繁殖季節(jié)均要顯著低于可育組，這