甘藍(lán)葉片卷曲關(guān)聯(lián)基因BoHB12和BoHB7的克隆與功能研究.pdf

1、結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea var.capitataL.），是十字花科蕓薹屬作物，簡(jiǎn)稱甘藍(lán)，是世界上最重要的葉用類蔬菜作物之一，在我國(guó)蔬菜生產(chǎn)與周年供應(yīng)中具有重要的地位。甘藍(lán)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)經(jīng)歷幼苗期、蓮座期和結(jié)球期，球葉向上向內(nèi)卷曲生長(zhǎng)，在結(jié)球期呈現(xiàn)半抱合狀態(tài)。對(duì)多數(shù)植物來而言，葉片卷曲破壞了葉片的平展性，影響其葉片正常的生理功能包括呼吸作用、光合作用、蒸騰作用等，但對(duì)以葉球?yàn)槭秤闷鞴俚慕Y(jié)球甘藍(lán)等作物而言卻是一種極有用的農(nóng)

2、藝性狀。球葉的數(shù)量與卷曲程度直接影響結(jié)球甘藍(lán)產(chǎn)品器官的單球重和葉球緊實(shí)度這兩大商品性狀。結(jié)球甘藍(lán)葉球的形成受內(nèi)源激素、光照、溫度、營(yíng)養(yǎng)、水分等因素的影響，是一個(gè)在環(huán)境因素誘導(dǎo)下的基因調(diào)控下的復(fù)雜生物學(xué)發(fā)生過程。葉片向內(nèi)向上卷曲是結(jié)球甘藍(lán)結(jié)球的重要特征，這為研究結(jié)球甘藍(lán)葉片卷曲的機(jī)制提供了材料。植物體接受外界信號(hào)刺激從而展開發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是其基因的表達(dá)與調(diào)控，所以對(duì)結(jié)球甘藍(lán)結(jié)球過程中葉片卷曲關(guān)聯(lián)基因與其表達(dá)的研究，將有助于解析結(jié)球甘藍(lán)結(jié)球

3、的分子機(jī)制，并為利用分子育種技術(shù)培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的結(jié)球甘藍(lán)品種提供理論依據(jù)。
　　作為一類植物中與發(fā)育有關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，同源異型盒(homeobox，HB)蛋白最顯著特征就是具有同源異型域(homeodomain，HD)，它是由61或60個(gè)氨基酸組成的一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域。植物同源異型盒蛋白家族根據(jù)同源異型域序列和位置的差異，以及它兩側(cè)序列的同源性與其他保守結(jié)構(gòu)域的不同，可以分為六大類，其中作為高等植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子——同源異

4、型-亮氨酸拉鏈蛋白(HD-Zip)，在植物細(xì)胞分化過程中有重要調(diào)控作用，HD-Zip又分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個(gè)亞類。已有研究發(fā)現(xiàn)擬南芥[Arabidopsis thaliana(L.) Heynh]的葉極性調(diào)控基因HYL1（HYPONASTICLEAVES1）調(diào)節(jié)HD-ZipⅢ基因的表達(dá)是通過介導(dǎo)miRNA來進(jìn)行的，HYL1基因缺失突變體hyl1表現(xiàn)葉片向內(nèi)卷曲，增量表達(dá)PHB、PHV、REV這3個(gè)HD-ZipⅢ基因，說明HD-Zip類基因

5、與葉片卷曲調(diào)控相關(guān)聯(lián)。
　　為了進(jìn)一步了解在甘藍(lán)結(jié)球過程中球葉卷曲調(diào)控中同源異型盒基因的作用。本研究以結(jié)球性良好的‘519’甘藍(lán)品系為試材，從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序出發(fā)，以同源異型盒基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過甘藍(lán)蓮座期葉片與球葉形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)比較研究、與甘藍(lán)結(jié)球過程中葉片卷曲相關(guān)的同源異型盒基因的克隆與分析、目的基因啟動(dòng)子GUS表達(dá)分析以及目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化甘藍(lán)的研究，闡述了同源異型盒基因在甘藍(lán)結(jié)球過程中對(duì)葉片卷曲的重要調(diào)節(jié)作用。
　　本研究主要獲

6、得了以下幾個(gè)方面的結(jié)果:
　　1.甘藍(lán)蓮座期葉片和結(jié)球期球葉的形態(tài)與組織結(jié)構(gòu)比較
　　通過同等大小的甘藍(lán)蓮座期葉與球葉的形態(tài)學(xué)觀察，并且通過石蠟切片法對(duì)葉片不同區(qū)域部位組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，結(jié)果表明:相對(duì)于綠色有葉柄葉片平展的蓮座期葉片，甘藍(lán)球葉淺黃色，無葉柄，葉片向上卷曲，葉形指數(shù)較小;相對(duì)于蓮座葉，球葉的葉片厚度增加，葉片中葉肉細(xì)胞分化發(fā)育相對(duì)蓮座葉延遲，只在葉片頂部區(qū)域分化發(fā)育出細(xì)胞排列緊密的柵欄組織和松散的海綿組織

7、，葉片中部區(qū)域沒有分化發(fā)育出柵欄組織和海綿組織，而蓮座葉在葉片中部區(qū)域就已經(jīng)分化發(fā)育出了柵欄組織和海綿組織。
　　對(duì)甘藍(lán)植株進(jìn)行了高溫脅迫和壓葉處理后的球葉形態(tài)變化觀察。結(jié)果表明:在自然狀態(tài)下519甘藍(lán)第34片葉為卷曲的球葉，而在30℃高溫處理下和壓葉處理后，第34片葉的形態(tài)變得更接近蓮座葉。這說明了高溫、光照等外界環(huán)境條件的變化對(duì)甘藍(lán)的結(jié)球與葉片卷曲有影響。
　　2.通過轉(zhuǎn)錄組分析篩選出的甘藍(lán)同源異型盒基因的克隆與表達(dá)分析

8、
　　通過結(jié)球期莖尖和葉片以及蓮座期莖尖和葉片的轉(zhuǎn)錄組分析，從中篩選出表達(dá)差異顯著的4個(gè)HB類基因，分別為BoHB12、BoHB7、BoHAT2和BoHB27。進(jìn)一步對(duì)上述4個(gè)基因以及調(diào)控?cái)M南芥葉片卷曲但在結(jié)球甘藍(lán)轉(zhuǎn)錄組中未檢測(cè)到表達(dá)差異的BoPHB、BoPHV和BoREV進(jìn)行了同源克隆。序列分析表明上述7個(gè)基因都含有同源異型域，具有同源異型盒蛋白家族的典型結(jié)構(gòu)特征。BlastP（蛋白序列與蛋白庫做比對(duì)）表明它們與擬南芥的同源蛋白

9、相似性高，來自結(jié)球甘藍(lán)的BoHB12、BoHB7、BoHAT2、BoHB27、BoPHV、BoPHB、BoREV與擬南芥中的ATHB12、ATHB7、HAT2、ATHB27、PHV、PHB、REV蛋白同源，它們的同源性分別為80％、79％、86％、60％、95％、94％和96％。BlastP比對(duì)和進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，BoHAT2屬于HD-ZipⅡ類，BoHB12和BoHB7屬于HD-ZipⅠ類，BoHB27屬于ZF-HD，BoPHB、B

10、oPHV和BoREV屬于HD-ZipⅢ類。BoHB12、BoHB7、BoHAT2、BoHB27、BoPHB、BoPHV、BoREV在結(jié)球甘藍(lán)蓮座期到結(jié)球期的莖尖和葉片中均有表達(dá)，BoHB12和BoHB7在結(jié)球期葉片中表達(dá)量顯著增高，分別是蓮座期葉片的38.1倍和6.2倍，其余基因表達(dá)量差異不明顯，表明BoHB12和BoHB7可能在結(jié)球甘藍(lán)球葉自然卷曲過程中的起到了主效調(diào)控作用。
　　3.BoHB12與BoHB7基因的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因

11、煙草中的表達(dá)特性分析
　　本研究分別構(gòu)建了BoHB12與BoHB7兩個(gè)基因的啟動(dòng)子的含GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體pCABarBoHB12PGUS和pCABarBoHB7PGUS，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得了相應(yīng)的煙草轉(zhuǎn)基因植株。通過轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色分析，結(jié)果表明，BoHB12的啟動(dòng)子在植株中在葉、莖部和根尖都有表達(dá)，而在幼葉中只在基部和葉尖表達(dá)，而且活性低;BoHB7的啟動(dòng)子在植株中葉、莖和根部都有表達(dá)，在幼葉中活性較低。<

12、br>　　4.BoHB12、BoHB7基因的甘藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化研究
　　在構(gòu)建中間載體時(shí)，通過酶切連接，同時(shí)將一個(gè)基因分兩個(gè)方向隨機(jī)插入到載體pBI525上，然后用其上游引物+NOS-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒別該基因的插入方向，這就同時(shí)構(gòu)建了一個(gè)基因的正義鏈中間載體和反義鏈中間載體。又通過酶切連接將正義鏈和反義鏈分別插入植物表達(dá)載體PCAMBIA1300-bar上，構(gòu)建了正義表達(dá)載體pCABarBoHB12和pCABarBoHB7與反義

13、表達(dá)載體pCABaranti-BoHB12和pCABaranti-BoHB7四個(gè)植物表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)和組織培養(yǎng)的方法轉(zhuǎn)化獲得了相應(yīng)的甘藍(lán)轉(zhuǎn)基因植株（35S∷anti-BoHB7轉(zhuǎn)基因不定芽未能生根）。其中BoHB12反義基因轉(zhuǎn)化獲得的甘藍(lán)35S∷anti-BoHB12轉(zhuǎn)基因植株的表型發(fā)生明顯變化，蓮座期葉片變小，葉面褶皺，葉片向下卷曲，不能形成葉球，與非轉(zhuǎn)基因植株葉片完全不同。通過對(duì)35S∷BoHB12轉(zhuǎn)基因植株和35S∷an

14、ti-BoHB12轉(zhuǎn)基因植株蓮座期葉片中的BoHB12、BoGA20ox1、BoGA20ox2、BoASA1、BoILL6、BoIAA12、BoTCP4、BoPHB、BoPHV進(jìn)行定量PCR分析，結(jié)果表明，35S∷BoHB12轉(zhuǎn)基因植株蓮座期葉片中的BoHB12基因過表達(dá)，35S∷anti-BoHB12轉(zhuǎn)基因植株蓮座期葉片中的BoHB12基因表達(dá)受到抑制;BoHB12主要調(diào)控BoGA20ox1的表達(dá)，還負(fù)調(diào)控BoIAA12和BoPHV的