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文檔簡(jiǎn)介
1、豬囊尾蚴病是全球性寄生性蠕蟲病,發(fā)展中國(guó)家更為常見,尤其在我國(guó),該病的流行給人民生產(chǎn)和生活帶來諸多危害,給人類的健康帶來嚴(yán)重的影響。我國(guó)至少已有31個(gè)省(市、自治區(qū))有過該病的報(bào)道,囊尾蚴病患者約1000萬,每年屠宰的囊尾蚴病豬約1200萬頭,直接經(jīng)濟(jì)損失約20億元。腦囊尾蚴病對(duì)人類的健康危害極大,在某些發(fā)展中國(guó)家,腦囊尾蚴病是引起人死亡的主要原因之一。 由于抗藥性的不斷出現(xiàn)以及藥物殘留等問題的嚴(yán)重性,使得利用免疫預(yù)防技術(shù)來取代
2、藥物成為控制豬囊尾蚴病的必然。免疫毒素是一種導(dǎo)向藥物,它將毒素基因和靶向基因融合,表達(dá)融合蛋白,具有識(shí)別和選擇性地破壞受體靶細(xì)胞的功能,它由導(dǎo)向部分和毒性部分組成。 綠膿桿菌外毒素通常作為重組毒素的毒性成分,其毒性本質(zhì)是它能夠催化真核細(xì)胞延伸因子的ADP核糖基化,阻止肽鏈延長(zhǎng)并中斷細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成而行使細(xì)胞毒作用。作為重組毒素的導(dǎo)向部分,除能夠與特定靶細(xì)胞表面受體結(jié)合外,同時(shí)能夠與毒素基因相融合,表達(dá)出融合蛋白,且二者不影響各自
3、獨(dú)立結(jié)構(gòu)和功能。將豬囊尾蚴頭節(jié)單鏈抗體基因與綠膿桿菌外毒素PE40基因連接,裝入表達(dá)載體pET-28(a)中,以獲得重組毒素,研究其對(duì)豬囊尾蚴的殺滅作用。 從綠膿桿菌ATCC27853菌株中提取基因組,根據(jù)GenBank發(fā)表的綠膿桿菌外毒素基因全序列,自行設(shè)計(jì)引物,分別引入XbaⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。 采用PCR方法擴(kuò)增PE40基因,在反應(yīng)體系中加入10%總體積的甘油,電泳檢測(cè),純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接
4、構(gòu)建質(zhì)粒pMD18-T-PE40,轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)JM109中,藍(lán)白斑篩選陽性克隆菌,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定及PCR鑒定,并測(cè)序。 質(zhì)粒pMD18-T-PE40經(jīng):XbaⅠ和HindⅢ雙酶切后電泳顯示2692bp和1083bp兩條帶,測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增的PE40基因共有10個(gè)堿基發(fā)生改變,變異的堿基引起7個(gè)氨基酸發(fā)生變化,但PE40肽段的重要活性位點(diǎn)與綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)毒株P(guān)A103相比均未發(fā)生變化。 含有ScFv基因的質(zhì)粒p
5、MD18-T-ScFv已經(jīng)構(gòu)建,且ScFv基因兩端的酶切位點(diǎn)分別為EcoRⅠ和XbaⅠ,用XbaⅠ和HindⅢ分別對(duì)質(zhì)粒pMD18-T-PE40和pMD18-T-ScFv進(jìn)行雙酶切,利用XbaⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)將PE40基因與質(zhì)粒pMD18-T-ScFv相連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)JM109中,挑取陽性菌酶切鑒定。 經(jīng)酶切電泳分析,得到大小約為1800bp的目的片段,與預(yù)期結(jié)果相同,說明ScFv與PE40已連接成功。用EcoR
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