抗豬囊尾蚴特異性單鏈抗體基因的克隆與序列分析.pdf

1、豬囊尾蚴病是豬肉絳蟲的幼蟲(豬囊尾蚴)寄生于豬的肌肉和其他器官中所引起的一種寄生蟲病，又稱豬囊蟲病。是一種散發(fā)性、傳染性寄生蟲病。本病呈世界性分布，在我國各地均有散發(fā)流行，尤其是東北、華北和西南廣大地區(qū)常有發(fā)生，不僅影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展，而且嚴(yán)重危害人體健康，是一種重要的人、畜共患病[1]。目前治療本病除了化學(xué)藥物以外還沒有生物制劑應(yīng)用。近年來隨著分子生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)方法的不斷完善，很多研究者正在試圖研制生物制劑。而單鏈抗

2、體(ScFv)和免疫毒素的應(yīng)用，對(duì)治療豬囊蟲病提供了更快捷、更徹底的方向。單鏈抗體(ScFv)由抗體重(Vh)、輕(Vl)鏈可變區(qū)通過與一段約5～25個(gè)氨基酸連接肽，一般為(Gly4Ser)3，拼接而成的重組蛋白。與完整抗體相比，單鏈抗體具有更大的優(yōu)越性[2]，它在非靶向組織中滯留時(shí)間短、血清清除速度快、組織穿透力強(qiáng)、其特異性可以在體外用免疫學(xué)方法篩選等優(yōu)點(diǎn)。更重要的是ScFv能在細(xì)菌中表達(dá)，便于基因操作和基因工程大量生產(chǎn)，還可用基因工

3、程的方法構(gòu)建與其它效應(yīng)分子連接的融合蛋白，因此ScFv可成為藥物、毒素、放射性物質(zhì)等導(dǎo)向靶細(xì)胞的理想載體。重疊延伸PCR(SOE PCR)技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來。此PCR技術(shù)能夠在體外進(jìn)行有效的基因重組，而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理，可利用這一技術(shù)很快獲得其它依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)先對(duì)豬囊尾蚴頭節(jié)特異性

4、單鏈抗體輕鏈可變區(qū)基因(Vl)和重鏈可變區(qū)基因(Vh)進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定，電泳結(jié)果顯示，在330bp和370bp左右出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。序列分析結(jié)果顯示出較高同源性，其中重鏈的同源性高達(dá)94％，輕鏈的同源性高達(dá)為96％。然后采用重疊延伸PCR(SOE PCR)技術(shù)，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)摸索反應(yīng)條件，變性溫度定義在94℃，40s，在第一輪PCR時(shí)，Tm值定義為58℃為最佳；在第二輪PCR時(shí)，Tm值定義為52℃為最佳。并且每一輪的循