豬生長(zhǎng)激素ELISA檢測(cè)體系的建立和應(yīng)用.pdf

1、豬生長(zhǎng)激素(porcine growth hormone，pGH)又稱豬促生長(zhǎng)素(porcine somatotropin，pST)，是由豬腦垂體前葉以脈沖方式分泌的約191個(gè)氨基酸的肽類激素，是調(diào)節(jié)豬正常生長(zhǎng)和發(fā)育的主要激素之一。它能促進(jìn)葡萄糖吸收、核酸與蛋白質(zhì)的合成以及脂肪的分解，提高豬的生長(zhǎng)速度，飼料報(bào)酬和瘦肉率。 近年來隨著雜交瘤技術(shù)的發(fā)展及pGH單克隆抗體的成功制備，為建立pGH ELISA測(cè)定技術(shù)提供了可能。酶聯(lián)免疫

2、吸附測(cè)定法(ELISA)由于具有無放射性污染、特異性強(qiáng)、靈敏度高、測(cè)定周期短、對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求不高等許多優(yōu)點(diǎn)，因而受到人們的普遍關(guān)注和重視。靈敏的ELISA檢測(cè)方法的建立，為開展豬生長(zhǎng)發(fā)育及生殖的GH調(diào)控及GH基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的研究提供了一種行之有效的GH檢測(cè)手段，對(duì)內(nèi)分泌學(xué)的研究進(jìn)程具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。 本試驗(yàn)采用豬生長(zhǎng)激素(pGH)免疫家兔制備了抗血清，經(jīng)飽和硫酸銨粗提得到兔抗pGH的IgG抗體，SDS-PAGE鑒定抗體的

3、純度，紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量達(dá)到21mg/mL；選取BALB/c小鼠，以豬生長(zhǎng)激素純品為抗原，進(jìn)行免疫，脾細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞融合篩選雜交瘤細(xì)胞。獲得了三株穩(wěn)定分泌豬生長(zhǎng)激素單克隆抗體的雜交瘤株，分別為1B4、1C4和2C5。和本課題組以前保存的其他三株單抗(1A3、1A5和1B5)同時(shí)進(jìn)行效價(jià)、親和力、Ig亞類及抗原識(shí)別位點(diǎn)等特性的鑒定，篩選出一株親和力和效價(jià)都較好的單克隆抗體(1B4)。 雙抗體夾心法采用一株抗pGH的單

4、克隆抗體(1B4)為包被抗體，以識(shí)別和結(jié)合待檢標(biāo)本中的pGH，兔抗pGH多抗可與pGH分子的另外表位結(jié)合，后加入HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為酶標(biāo)抗體，并催化底物顯色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待檢標(biāo)本中的pGH含量，成功地建立了pGH的雙抗體夾心ELISA法。pGH含量在0.02μg/mL～2.0μg/mL范圍內(nèi)，濃度對(duì)數(shù)與其OD490nm值呈線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品中pGH含量由標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)

5、照計(jì)算得出，最低檢測(cè)限為50ng/mL。此方法具有快速、靈敏、特異的特點(diǎn)。 在實(shí)際應(yīng)用中分別測(cè)出60、120、180日齡的松遼黑豬血液中激素含量是0.601±0.012μg/mL、0.801±0.014μg/mL、0.924±0.022μg/mL。其中180日齡豬血液中生長(zhǎng)激素含量與國內(nèi)報(bào)道同日齡豬相符合。 本研究意在利用豬生長(zhǎng)激素純品去免疫BALB/c小鼠，進(jìn)而構(gòu)建具有穩(wěn)定分泌豬生長(zhǎng)激素單抗的雜交瘤株，再利用豬生長(zhǎng)激素