生長激素長期刺激導(dǎo)致肝臟生長激素不敏感效應(yīng)的研究.pdf

1、目的：
　　生長激素在人體最重要的靶器官是肝臟，其在肝臟中主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是JAK-STAT通路，而STAT5是該信號(hào)通路最主要的效應(yīng)信號(hào)因子，本研究將同時(shí)從細(xì)胞水平與在體水平，檢測(cè)生長激素長期刺激下肝臟STAT5磷酸化水平的變化，進(jìn)而探究生長激素長期刺激對(duì)肝臟JAK-STAT信號(hào)通路的影響。
　　方法：
　　1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分:本課題選擇人肝癌細(xì)胞系Hep G2，以含10％（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于3

2、7℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　1.1 Hep G2對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞均勻傳代至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的8個(gè)孔，以含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增長至90％左右時(shí)將培養(yǎng)基換為不含血清的DMEM進(jìn)行9小時(shí)血清饑餓，然后將細(xì)胞分為4組:0min rhGH組，10min rhGH組，30min rhGH組與50min rhGH組，每組2孔。按分組情況予各組工作濃度3000ng/ml的重組人生長激素分別刺激50分鐘、30分鐘、1

3、0分鐘、0分鐘，每組添加刺激時(shí)其余各組予等體積無血清DMEM。刺激結(jié)束后以RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白檢測(cè)p-STAT5水平。
　　1.2 12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中放置清潔光滑的無菌蓋玻片，Hep G2對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞均勻傳代接種6個(gè)孔，控制細(xì)胞密度在30％左右，以含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁牢固后立即將培養(yǎng)基換為不含血清的DMEM進(jìn)行9小時(shí)血清饑餓，然后將細(xì)胞分為3組:0min rhGH組，20min

4、rhGH組，60min rhGH組，每組2孔。按分組情況予各組工作濃度3000ng/ml的重組人生長激素分別刺激60分鐘、20分鐘、0分鐘，每組添加刺激時(shí)其余各組予等體積無血清DMEM。刺激結(jié)束后常溫下移出細(xì)胞玻片，以4％多聚甲醛固定后檢測(cè)p-STAT5水平。
　　1.3 Hep G2對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞均勻傳代至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的4個(gè)孔，以含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，控制細(xì)胞牢固貼壁時(shí)細(xì)胞密度在40-50％左右，之后將培養(yǎng)基

5、換為含2％胎牛血清的DMEM，并將細(xì)胞分為生長激素長期刺激組與對(duì)照組，每組2孔。GH長期刺激組每日予工作濃度3000ng/ml的重組人生長激素刺激共3天，對(duì)照組每日予等體積無血清DMEM，控制末次添加刺激后24小時(shí)細(xì)胞密度增長至90％左右，之后將培養(yǎng)基換為不含血清的DMEM進(jìn)行9小時(shí)血清饑餓，最后再予每組添加一次單劑量重組人生長激素（工作濃度3000ng/ml）作為閾上刺激，刺激30分鐘后將細(xì)胞置于冰上以RIPA裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋

6、白檢測(cè)p-STAT5水平。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分:本課題選擇6-8周齡的健康BALB/c雄性小鼠12只隨機(jī)分為生長激素長期刺激組與對(duì)照組，每組6只。GH長期刺激組按1ug/g體重/次的劑量予每日1次腹腔注射重組人生長激素，對(duì)照組注射等體積生理鹽水，共3周。末次注射后16小時(shí)于次日上午8:00處死。處死前30分鐘每組隨機(jī)選出3只予腹腔注射1次單劑量重組人生長激素（1ug/g體重），其余6只注射等體積生理鹽水。12只小鼠最終分為4組:

7、對(duì)照組，GH單劑量刺激組，GH長期刺激組，GH長期+單劑量刺激組。全部刺激完成后，所有小鼠以水合氯醛充分麻醉，迅速摘取小鼠肝臟存于液氮中，之后移至-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。冰上研磨小鼠肝臟組織，以RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞，提取組織蛋白檢測(cè)p-STAT5水平。實(shí)驗(yàn)過程中，確保每日腹腔注射的時(shí)間一致，小鼠處死的時(shí)間點(diǎn)相同。每次注射兩組交叉進(jìn)行。
　　3.蛋白信號(hào)分子的測(cè)定
　　3.1 實(shí)驗(yàn)1.1與實(shí)驗(yàn)1.3中提取的Hep G

8、2細(xì)胞總蛋白，及實(shí)驗(yàn)2中提取的小鼠肝臟組織蛋白，應(yīng)用蛋白免疫印跡法(Western Blot，WB)檢測(cè)p-STAT5水平。
　　3.2 Hep G2細(xì)胞爬片，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光法（Immunofluorescence）染色后于熒光顯微鏡下觀察p-STAT5蛋白信號(hào)的熒光強(qiáng)度，檢測(cè)p-STAT5水平。
　　4.統(tǒng)計(jì)分析
　　全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用WPS Excel2015記錄，并使用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“

9、算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（arithmetic mean±standard deviation，M±SD）”表示。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent Samples T Test)或Satterthwaite近似t檢驗(yàn)（滿足或不滿足方差齊性）。以P值＜0.05為存在顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.體外研究（細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)）中生長激素長期刺激對(duì)Hep G2細(xì)胞p-STAT5水平的影響
　　1.

10、1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，50min rhGH組的Hep G2細(xì)胞p-STAT5水平（灰度值:0.55±0.18）顯著低于10min rhGH組與30min rhGH組的Hep G2細(xì)胞(灰度值分別為1.45±0.39，1.49±0.22)，（P值=0.023 vs.10min rhGH組，P值=0.005 vs.30minrhGH組）;而10min rhGH組與30min rhGH組的Hep G2的p-STAT5水平則無顯著差異(P值=0.8

11、79)。
　　1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，60min rhGH組的Hep G2細(xì)胞的p-STAT5蛋白信號(hào)熒光強(qiáng)度明顯弱于20min rhGH組的Hep G2細(xì)胞。
　　1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(灰度值:1.41±0.41)相比，GH長期刺激組Hep G2細(xì)胞的p-STAT5水平（灰度值:0.76±0.31）顯著下降（P值=0.026）。
　　2.體內(nèi)研究（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)）中生長激素長期刺激對(duì)小鼠肝臟p-STAT5水平的影響

12、
　　2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(灰度值:1.47±0.45)相比，GH長期刺激組的小鼠肝臟p-STAT5水平（灰度值:0.42±0.06）顯著降低。（P值=0.016）
　　2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GH長期+單劑量刺激組小鼠肝臟p-STAT5水平(灰度值:2.05±0.33)顯著高于GH長期刺激組的小鼠（灰度值:0.17±0.03）。(P值=0.01)
　　2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GH長期+單劑量刺激組小鼠肝臟的p-

13、STAT5水平(灰度值:1.29±0.34)顯著低于GH單劑量刺激組(灰度值:3.48±0.88)。(P值=0.036)
　　結(jié)論：
　　1.在細(xì)胞培養(yǎng)水平，生長激素長期刺激可抑制STAT5磷酸化，抑制JAK-STAT信號(hào)通路。
　　2.在健康小鼠模型中，生長激素長期刺激可抑制STAT5磷酸化，抑制JAK-STAT信號(hào)通路，并可致小鼠肝臟對(duì)生長激素的敏感性降低。
　　3.結(jié)合本研究前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果推論，長期的生長激素