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文檔簡介
1、第一部分 VEGF-D/VEGFR-3在人乳腺良、惡性病變中的表達(dá)
1、目的:檢測VEGF-D/VEGFR-3在乳腺良、惡性組織中的表達(dá),并進(jìn)行淋巴管計數(shù)。
2、材料和方法:
乳腺癌標(biāo)本40例、良性病變80例,real-time qPCR技術(shù)檢測乳腺組織中VEGF-D/VEGFR-3mRNA水平的表達(dá),免疫組化方法檢測VEGF-D/VEGFR-3在蛋白水平的表達(dá)并計數(shù)D2-40標(biāo)記的陽性染色淋巴管數(shù)量(LV
2、D)。
3、結(jié)果:
以real-time qPCR方法檢測VEGF-D mRNA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織、乳腺良性組織中存在明顯差異,其在乳腺癌組織中表達(dá)量明顯高于乳腺良性組織(P<0.05);VEGFR-3 mRNA在乳腺癌組織中表達(dá)量明顯高于乳腺良性組織,存在明顯差異(P<0.05)。
用免疫組化方法檢測VEGF-D/VEGFR-3蛋白水平的表達(dá)情況,結(jié)果顯示二者在乳腺癌組織中均呈不同程度的高表達(dá),陽性
3、染色計數(shù)顯著高于良性組織中,差異顯著(P<0.05);同時計數(shù)了D2-40標(biāo)記的陽性淋巴管密度(LVD),亦在惡性組織中有更高的表達(dá)。
4、結(jié)論:
real-time qPCR技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)用于乳腺組織中VEGF-D/ VEGFR-3的檢測是可行的。
乳腺癌中VEGF-D/VEGFR-3的表達(dá)以及淋巴管密度(LVD)顯著高于良性乳腺組織,在mRNA和蛋白水平的差異都有統(tǒng)計學(xué)意義。
VEGF
4、-D及其受體可能可以作為研究乳腺癌轉(zhuǎn)移和侵襲能力的參考指標(biāo)。
第二部分人乳腺癌中VECF-D/VEGFR-3表達(dá)的臨床意義
1、目的:
結(jié)合乳腺癌臨床病理特征分析VECF-D/VEGFR-3異常表達(dá)的臨床意義和研究價值。
2、材料和方法:
選用同一批樣本,收集每位患者的手術(shù)史、腫瘤大小、病理分級、分型、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和其他相關(guān)腫瘤指標(biāo)包括,雌激素受體(ER)、孕激素受
5、體(PR)、人表皮生長因子受體-2(Her2),采用統(tǒng)一的免疫組化染色評分標(biāo)準(zhǔn),分析乳腺癌中VECF-D/VEGFR-3表達(dá)的臨床意義。
3、結(jié)果
40例樣本中,VEGF-D32例陽性表達(dá),瘤內(nèi)高表達(dá)28例(70%),而在腫瘤周邊表達(dá)相對弱,高表達(dá)為9例(22.5%),標(biāo)本不同部位的高表達(dá)的例數(shù)相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);VEGFR-3可見陽性細(xì)胞的有37例(92.5%),瘤內(nèi)呈高表達(dá)者19例(47.5%),瘤
6、周高表達(dá)者22例(55%),標(biāo)本中不同部位高表達(dá)的例數(shù)沒有顯著區(qū)別(P>0.05);D2-40標(biāo)記陽性例數(shù)為40例(100%),不論染色強(qiáng)弱,以陽性淋巴管密度(LVD)作為評價指標(biāo),瘤周顯著高于腫瘤實質(zhì)內(nèi)(P<0.05)。
VEGF-D在瘤內(nèi)的高表達(dá)與VEGFR-3密切相關(guān),而瘤周的表達(dá)與VEGFR-3無關(guān)。VEGF-D的表達(dá)水平和乳癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的病理分級、Her2的表達(dá)和LVD數(shù)值密切相關(guān),有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0
7、5),與患者年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、ER、PR、一年期無進(jìn)展無相關(guān)性(P>0.05)。
VEGFR-3的表達(dá)水平和患者淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05),和患者的其他臨床因素沒有顯著相關(guān)性(P>0.05)。
LVD計數(shù)在瘤周顯著高于瘤內(nèi)(P<0.05),與病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05),與其他因素?zé)o相關(guān)性(P>0.05)。
4、結(jié)論
乳腺癌中VEGF-D和LVD的表達(dá)存在位置特異性,
8、前者瘤內(nèi)表達(dá)強(qiáng),后者瘤周表達(dá)強(qiáng)于瘤內(nèi),并且與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理級別和Her2表達(dá)有關(guān);VEGFR-3的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),三者均是研究乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的有價值的指標(biāo)。
第三部分靶向VEGF-D的shRNA構(gòu)建及其對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長和侵襲的影響
1、目的:
構(gòu)建靶向VEGF-D的shRNA,在細(xì)胞實驗中驗證其穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)染效率和生物學(xué)功能。
2、材料和方法:
按照shR
9、NA序列設(shè)計原則設(shè)計并合成3條針對VEGF-D基因的shRNA,挑選最有效抑制 VEGF-D基因表達(dá)的一條干擾序列,轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231,Western-blot檢測轉(zhuǎn)染特異shRNA后乳腺癌細(xì)胞VEGF-D和VEGFR-3的蛋白表達(dá)情況,計數(shù)細(xì)胞存活比率,MTT法檢測細(xì)胞增殖。
3、結(jié)果:
成功構(gòu)建了正確的靶向VEGF-D的shRNA,其中一條干擾RNA降低 VEGF-D的mRNA和蛋白表達(dá)的能力最強(qiáng)
10、,命名為shRNA1,同時建立對照組。檢測細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)干擾組和對照組沒有顯著差別(P>0.05),MTT法檢測細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長未受明顯影響(P>0.05);VEGFR-3蛋白的表達(dá)明顯下降(P<0.05),Transwell小室實驗發(fā)現(xiàn)干擾組穿過人工基質(zhì)的能力明顯下降(P<0.05)。
4、結(jié)論:
靶向VEGF-D的shRNA能顯著降低VEGF-D和VEGFR-3的表達(dá),并能抑制腫瘤細(xì)胞在體外的侵襲能力,應(yīng)該是一
11、種有效的下調(diào)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的策略。
第四部分VEGF-D shRNA抑制乳腺癌的動物實驗研究
1、目的:
以VEGF-D shRNA處理乳腺癌荷瘤鼠模型,觀察腫瘤生長和實驗動物生存的的變化,通過體內(nèi)實驗分析該干擾策略的潛在應(yīng)用價值。
2、材料和方法:
建立乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的荷瘤小鼠模型,以前面實驗中構(gòu)建的VEGF-D shRNA干擾小鼠種植瘤的生長,并建立對照組。觀察各組
12、小鼠腫瘤的體積、重量,小鼠的生存時間、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)和LVD計數(shù)的差異。
3、結(jié)果:
RNA干擾組小鼠腫瘤生長減慢,觀察終止時重量、體積均明顯小于對照組(P<0.05),表現(xiàn)出明顯的抑瘤率(P<0.05),生存時間明顯改善(P<0.05);血清中VEGFR-3的含量沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異(P>0.05);LVD計數(shù)在RNA干擾組有明顯的減少(P<0.05)。
4、結(jié)論:
以靶向VEG
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