腫瘤來源自噬小體(DRibbles)活化B細胞及其功能的研究.pdf

1、自噬(autophagy)是細胞利用溶酶體降解胞漿中受損或廢棄的細胞器及不再需要的大分子物質(zhì)的過程。自噬過程中形成的雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡稱為自噬小體(autophagosome)。自噬對細胞的能量循環(huán)、代謝、細胞器的更新及維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)有非常重要的作用。研究表明，許多腫瘤細胞都存在自噬活性的改變，細胞自噬與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療之間存在著重要的相關(guān)性。通過誘導(dǎo)自噬及抑制溶酶體/蛋白酶體的活性，細胞內(nèi)大量的長壽蛋白、短壽蛋白、核糖體錯誤編碼的

2、產(chǎn)物(DRiPs)包裹在自噬小體中。這種的自噬小體被稱為DRibbles(DRiPs-containing blebs)。研究發(fā)現(xiàn)，DRibbles中包含了多種損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)分子，包括熱休克蛋白(HSPs)、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin)以及高遷移率族蛋白1(HMGB1)等。DRibbles中包含的這些的模式分子可以作為天然佐劑在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。已經(jīng)證明，DRibbles是“交叉遞呈”腫瘤抗原的有效載體

3、，樹突細胞(DCs)能通過細胞質(zhì)膜微囊及網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的方式將DRibbles中所含的腫瘤抗原交叉遞呈給T細胞，進而誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答。
　　B細胞最重要的功能是分化為漿細胞分泌抗體并介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答?？贵w通過誘導(dǎo)保護性的抗體應(yīng)答可作為機體抗感染的第一道屏障。B細胞能通過BCR特異性的識別可溶性抗原和細胞膜相關(guān)抗原，并產(chǎn)生應(yīng)答。新近研究證明，B細胞表達幾乎所有亞型的TLRs，能夠識別病原相關(guān)的分子模式(PAMPs)，在B細胞增殖、分

4、化、細胞因子和抗體分泌等方面起調(diào)節(jié)作用，被稱為B細胞活化的第三信號。B細胞除了可在體液免疫中發(fā)揮重要作用外，還可以作為專職的抗原遞呈細胞，在特定條件下可以有效地交叉遞呈抗原。然而，靜息的B細胞不能激活初始T細胞(Na(i)ve T cells)，反而會使它失活。有研究采用脂多糖(LPS)等刺激活化B細胞可以上調(diào)B細胞表面MHCⅠ類、Ⅱ類分子以及共刺激分子CD80/86等，但依舊無法有效活化初始T細胞，尤其是初始CD8+T細胞。有研究證明

5、，聯(lián)合CD40分子（轉(zhuǎn)染CD40L的3T3細胞、可溶性的CD40L三聚體、抗CD40抗體等）、細胞因子IL-4及TLR激活劑(LPS、CpG等)，可在體外活化外周血來源的B細胞，上調(diào)其表面MHCⅠ類和Ⅱ類分子以及共刺激分子CD80/86的表達，誘導(dǎo)B細胞大量增殖。并且活化的B細胞負載抗原（腫瘤細胞裂解液、短肽、逆轉(zhuǎn)錄病毒/RNA轉(zhuǎn)染抗原或病毒抗原等）后，在體外能誘導(dǎo)抗原特異性的初始CD8+T細胞及CD4+T細胞免疫應(yīng)答。許多研究也證明，

6、活化的B細胞可以誘導(dǎo)抗原特異性的T細胞應(yīng)答進而具有抗腫瘤效應(yīng)。我們的前期實驗中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞自噬小體DRibbles能誘導(dǎo)B細胞增殖、活化并分泌腫瘤抗原特異性抗體，但自噬小體活化B細胞的分子機制及其抗腫瘤作用尚不清楚。
　　目的:
　　研究腫瘤來源自噬小體(DRibbles)活化B細胞分子機制;研究B細胞交叉遞呈DRibbles抗原誘導(dǎo)T細胞應(yīng)答及其抗腫瘤作用的效果及其免疫學(xué)機制。
　　方法:
　　1.用DRib

7、bles刺激野生型、TLR2-/-、TLR4-/-和MyD88-/-小鼠脾臟B細胞，檢測TLRs在DRibbles誘導(dǎo)的B細胞活化中的作用。DRibbles與小鼠脾臟B細胞孵育不同時間(0、20、40、60min)，western blot法分析NF-kB通路中I-kBα和IKKα/β的磷酸化水平，探討DRibbles活化小鼠B細胞的信號通路。采用HMGB1抗體封閉DRibbles中的HMGB1抗原表位，然后與磁珠分選的小鼠脾臟B細胞共

8、孵育，檢測B細胞MHCⅡ類分子與CD86的表達以及培養(yǎng)上清中IL-6、IL-10和總IgM含量，探討HMGB1對DRibbles刺激B細胞活化的影響。采用FilipinⅢ封閉B細胞中caveolae介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞，然后與DRibbles共孵育，檢測caveolae介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞對DRibbles刺激B細胞活化的作用。
　　2.采用DRibbles(OVA+)免疫OT-1小鼠的淋巴結(jié)細胞作為效應(yīng)T細胞，體外與單獨DRibbles、單

9、獨B細胞、負載DRibbles或腫瘤細胞裂解液的小鼠B細胞共孵育5天，單獨的培養(yǎng)基和OT-1 peptide SIINFEKL分別作為陰性和陽性對照。采用流式細胞術(shù)檢測CFSE標(biāo)記的OT-1效應(yīng)T細胞的增殖。分選DRibbles免疫小鼠的效應(yīng)CD4+T和CD8+T細胞，與負載DRibbles的野生型、TLR2-/-、TLR4-/-和MyD88-/-小鼠B細胞分別孵育72h，ELISA及胞內(nèi)染色法檢測細胞分泌IFN-γ的含量;分選DRib

10、bles免疫小鼠的效應(yīng)CD4+T和CD8+T細胞，與負載αHMGB1封閉DRibbles的B細胞共孵育，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量，探討DRibbles抗原刺激效應(yīng) T細胞再活化的物質(zhì)基礎(chǔ);分選DRibbles免疫小鼠的效應(yīng)CD4+T和CD8+T細胞，與負載DRibbles的野生型及FilipinⅢ處理的B細胞分別孵育72h，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量，探討B(tài)細胞交叉遞呈DRibbles抗原、誘導(dǎo)

11、效應(yīng)T細胞再活化的分子機制。
　　3.皮下接種小鼠T淋巴瘤細胞—EG7構(gòu)建小鼠淋巴瘤模型，第7天采用淋巴結(jié)注射DRibbles(OVA+)作為首次免疫同時伴隨或不伴隨OT-1 T細胞的尾靜脈回輸，第10，14天以尾靜脈注射以CpG、抗CD40抗體預(yù)處理或不處理的B/DRibbles(OVA+)疫苗、DC/DRibbles方式進行加強免疫，并以單獨B細胞及未免疫組作為對照，定期測量檢測實體瘤大小以觀察B/DRibbles疫苗在抗腫瘤

12、效應(yīng)中的作用;收獲上述小鼠的腫瘤組織、脾臟組織以及血清，采用流式細胞儀檢測腫瘤組織浸潤CD4+T和CD8+T細胞的比例、脾臟細胞中IFN-γ+CD4+T和IFN-γ+CD8+T細胞的比例;采用ELISA檢測血清中抗EG7腫瘤抗原特異性抗體的水平，探討B(tài)/DRibbles疫苗能否增強DRs疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及其抗腫瘤作用。
　　4.采用OT-1小鼠的淋巴結(jié)細胞作為初始T細胞，體外與單獨DRibbles(OVA+)、單獨B細胞、負載D

13、Ribbles(OVA+)或腫瘤細胞裂解液的小鼠B細胞共孵育5天，單獨的培養(yǎng)基和OT-1 peptide SIINFEKL分別作為陰性和陽性對照。采用流式細胞術(shù)檢測CFSE標(biāo)記的OT-1初始T細胞的增殖。B/DRibbles(OVA+)疫苗首次免疫并同時伴隨OT-1 T細胞的尾靜脈回輸，3，6天后尾靜脈注射B/DRibbles(OVA+)疫苗進行加強免疫，并以單獨B細胞及未免疫組作為對照，第10天收獲上述小鼠脾臟即淋巴結(jié)組織，采用流式細

14、胞儀檢測體內(nèi)OT-1 T細胞的增殖。皮下接種小鼠T淋巴瘤細胞—EG7構(gòu)建小鼠淋巴瘤模型，第7天采用淋巴結(jié)注射以CpG、抗CD40抗體預(yù)處理或不處理的B/DRibbles(OVA+)疫苗作為首次免疫同時伴隨或不伴隨OT-1 T細胞的尾靜脈回輸，第10，14天以尾靜脈注射以CpG、抗CD40抗體預(yù)處理或不處理的B/DRibbles(OVA+)疫苗、DC/DRibbles(OVA+)方式進行加強免疫，并以單獨B細胞及未免疫組作為對照，定期測量

15、檢測實體瘤大小以觀察B/DRibbles(OVA+)疫苗在抗腫瘤效應(yīng)中的作用;收獲上述小鼠的腫瘤組織、脾臟組織以及血清，采用流式細胞術(shù)檢測腫瘤組織浸潤CD4+T和CD8+T細胞的比例、脾臟細胞中IFN-γ+CD4+T和IFN-γ+CD8+T細胞的比例;采用ELISA檢測血清中抗EG7腫瘤抗原特異性抗體的水平，探討負載B/DRibbles(OVA+)疫苗能否誘導(dǎo)初始T細胞應(yīng)答及其抗腫瘤作用。
　　結(jié)果:
　　1.與正常小鼠及T

16、LR4-/-小鼠相比，DRibbles不能上調(diào)TLR2-/-、MYD88-/-敲除小鼠B細胞表面MHCⅡ類分子、共刺激分子CD86的表達，IL-6、IL-10和總IgM水平也明顯降低。DRibbles與小鼠脾臟B細胞孵育后能引起下游NF-kB信號通路中I-kBα及IKKα/β的磷酸化。HMGB1抗體封閉DRibbles刺激B細胞表面MHCⅡ類分子及CD86的表達的上調(diào)作用顯著低于未封閉DRibbles及同型對照抗體封閉DRibbles組

17、，HMGB1抗體封閉DRibbles刺激B細胞產(chǎn)生IL-6、IL-10和總IgM水平也明顯低于未封閉DRibbles及同型對照抗體封閉DRibbles組。DRibbles刺激FilipinⅢ封閉的B細胞表面MHCⅡ類分子及CD86的表達的上調(diào)作用顯著低于未封閉B細胞組，產(chǎn)生IL-6、IL-10和總IgM水平也明顯低于未封閉組。
　　2.體外負載DRibbles(OVA+)的B細胞能交叉遞呈DRibbles(OVA+)抗原誘導(dǎo)OT-

18、1效應(yīng)T細胞的增殖明顯高于單獨DRibbles組、單獨B細胞組及B細胞負載腫瘤細胞裂解液組。與正常小鼠及TLR4-/-小鼠相比，TLR2-/-、MYD88-/-敲除小鼠B細胞攝取DRibbles刺激特異性效應(yīng)CD8+T和CD4+T細胞分泌IFN-γ的水平顯著降低。B細胞攝取HMGB1抗體封閉的DRibbles刺激特異性效應(yīng)CD8+T和CD4+T細胞分泌IFN-γ的水平明顯低于未封閉DRibbles及同型對照抗體封閉DRibbles組。F

19、ilipinⅢ處理的B細胞攝取DRibbles刺激特異性效應(yīng)CD8+T和CD4+T細胞分泌IFN-γ的水平亦明顯低于未封閉B細胞組。
　　3.在C57BL/6小鼠的EG7皮下移植瘤模型中，B/DRibbles(OVA+)疫苗加強免疫能增強DRs疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，過繼轉(zhuǎn)移OT-1細胞，腫瘤消除，小鼠可以正常生存;若不過繼OT-1細胞，可顯著抑制小鼠EG7模型的腫瘤生長，小鼠生存時間延長;B/DRibbles疫苗加強免疫荷瘤小鼠后，

20、能誘導(dǎo)有效的效應(yīng)T細胞應(yīng)答，能顯著提高腫瘤組織中浸潤CD4+T和CD8+T細胞的比例。同時發(fā)現(xiàn)，B/DRibbles疫苗加強免疫能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的腫瘤抗原特異性抗體IgM、IgG。聯(lián)合應(yīng)用CpG和抗CD40抗體優(yōu)化的B/DRibbles疫苗進行三次免疫后，腫瘤消除，小鼠得以正常生存，并能引發(fā)高水平的效應(yīng)T細胞應(yīng)答。
　　4.體外負載DRibbles(OVA+)的B細胞能交叉遞呈DRibbles抗原誘導(dǎo)OT-1初始T細胞的增殖明顯高于

21、單獨DRibbles組、單獨B細胞組及B細胞負載腫瘤細胞裂解液組。B/DRibbles(OVA+)疫苗能在體內(nèi)交叉遞呈DRibbles抗原活化初始OT-1 T細胞。在C57BL/6小鼠的EG7皮下移植瘤模型中，過繼轉(zhuǎn)移OT-1細胞，腫瘤消除，小鼠可以正常生存;若不過繼OT-1細胞，可顯著抑制小鼠EG7模型的腫瘤生長，小鼠生存時間延長;B/DRibbles疫苗免疫荷瘤小鼠后，能誘導(dǎo)有效的效應(yīng)T細胞應(yīng)答，能顯著提高腫瘤組織中浸潤CD4+T和

22、CD8+T細胞的比例。同時發(fā)現(xiàn)，B/DRibbles疫苗免疫能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的腫瘤抗原特異性抗體IgM、IgG。聯(lián)合應(yīng)用CpG和抗CD40抗體優(yōu)化的B/DRibbles疫苗進行三次免疫后，能引發(fā)高水平的效應(yīng)T細胞應(yīng)答，可以增強抗腫瘤效果，但依然沒有使腫瘤消退，需要進一步優(yōu)化條件。
　　結(jié)論:
　　1.DRibbles活化B細胞依賴TLR2-MyD88-NF-κB信號通路。DRibbles所含內(nèi)源性危險信號分子HMGB1與B細胞

23、的活化有密切關(guān)系。Caveolae(細胞質(zhì)膜微囊)介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞作用(endocytosis)與DRibbles誘導(dǎo)B細胞活化有密切關(guān)系。
　　2.B細胞能有效交叉遞呈DRibbles抗原并刺激效應(yīng)CD4+T和CD8+T細胞的再活化及分泌IFN-γ，該作用依賴B細胞的TLR2/MyD88信號通路。DRibbles所含內(nèi)源性危險信號分子HMGB1與B細胞交叉遞呈DRibbles刺激效應(yīng)CD4+T和CD8+T細胞的再活化有密切關(guān)系。C

24、aveolae(細胞質(zhì)膜微囊)介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞(endocytosis)與B細胞交叉遞呈DRibbles抗原并刺激效應(yīng)CD4+T和CD8+T細胞再活化有密切關(guān)系。
　　3.B/DRibbles加強免疫能增強DRibbles疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及其抗腫瘤作用;聯(lián)合應(yīng)用CpG和抗CD40抗體能有效加強B/DRibbles疫苗的抗腫瘤作用。
　　4.B/DRibbles首次免疫能誘導(dǎo)抗原特異性初始T細胞免疫應(yīng)答及抗腫瘤作用;聯(lián)合CpG