人骨髓間質干細胞來源exosomes分離鑒定及其對腫瘤細胞生長作用.pdf

1、目的:分離培養(yǎng)人骨髓間質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs),建立MSCs來源外切體(MSC-exosomes)分離純化方法,鑒定MSCs來源的exosomes并初步分析其生物學特性；體內外研究MSC—exosomes對腫瘤細胞生長的影響。
　　 方法:采用ficoll密度梯度離心法分離培養(yǎng)人骨髓MSCs；利用超濾及梯度離心法從MSCs培養(yǎng)上清中分離并純化MSC-exosomes,通過透射電鏡進行形態(tài)

2、觀察及Western-blot檢測exosomes表面相關蛋白CD9、CD81對其進行鑒定；將分離純化的MSC-exosomes與腫瘤細胞SGC-7901進行BALB／c裸鼠皮下共注射建立皮下致瘤模型,通過觀察比較致瘤效果和瘤體積的大小來研究MSC-exosomes在體內對腫瘤生長的影響；綜合運用組織病理學、免疫組織化學、Western blotting及RT-PCR等技術比較MSC-exosomes與SGC-7901細胞共注射組與對照

3、組瘤組織的特性；分別采用MTT法及流式細胞術測定不同濃度的MSC-exosomes作用SGC-7901細胞后其增殖活性及細胞周期的改變來研究exosomes在體外對腫瘤細胞的生長作用,并通過RT-PCR及Western blotting檢測腫瘤血管生長及細胞增殖相關基因或蛋白的變化,初步探討MSC-exosomes對腫瘤細胞作用的可能機制。
　　 結果:采用超濾及梯度離心法成功分離純化得到人骨髓MSCs分泌的exosomes,電

4、鏡下MSC-exosomes呈橢圓或碟狀的囊泡結構,直徑約40 nm～100 nm。MSC-exosomes含有其來源MSCs的成分及特征,并表達exosomes相關蛋白CD9、CD81；裸鼠皮下致瘤模型發(fā)現MSC-exosomes與SGC-7901共注射組腫瘤的生長速度較MSCs與SGC-7901共注射組相似,比SGC-7901單獨接種組腫瘤生長速度明顯加快。各組腫瘤組織HE染色及α-SMA,VEGF,CD34,FⅧ及PCNA免疫組化

5、染色結果顯示MSC-exosomes與腫瘤細胞共注射組的瘤組織含有豐富的血管。體外Western blotting檢測表明MSC-exosomes能夠引起腫瘤細胞ERK的瞬時活化,但MTT分析及流式細胞術檢測細胞周期結果表明MSC-exosomes體外作用SGC-7901細胞后其細胞數量及細胞在G0／G1、S及G2／M各階段的比例與未處理的SGC-7901細胞相比無明顯差異。
　　 結論:采用超濾及梯度離心法可以成功從間質干細胞