北京油雞部分重要形狀基因克隆及purh基因3種表達載體構(gòu)建.pdf

1、利用RT-PCR方法擴增PURH、CD3δ、CD3ε、CD8α、IFNαreceptorl、IFNαreceptor2、IFNy receptor2、RBMX、PEPD、WRB等10個基因。采用組織塊貼壁培養(yǎng)法，成功地構(gòu)建北京雞成纖維靶細胞系。提取北京油雞心、肝、脾、肺、腎、腦、腿肌與胸肌等不同組織的總RNA，檢測PURH基因mRNA的差異表達水平。將PURH基因完整開放閱讀框重組至真核表達載體pEGFP-N3，pEYFP-N1及pDs

2、Red1-N1，成功構(gòu)建帶有報告基因的3種真核重組表達載體。脂質(zhì)體介導(dǎo)導(dǎo)入北京油雞體外培養(yǎng)成纖維細胞中，對PURH基因的時空表達、亞細胞定位、陽性細胞生長、增殖狀況、細胞活力以及提高基因表達率的最佳方法等方面進行了深入的研究；并利用G418藥物篩選和對熒光強度高的單克隆化培養(yǎng)。實驗結(jié)果如下： 1.將10個基因側(cè)序后提交Genbank。 2.根據(jù)ATCC的細胞庫鑒定內(nèi)容與評價標(biāo)準(zhǔn)，對所構(gòu)建細胞系進行了生物學(xué)性狀研究、鑒定和

3、綜合評價，所得結(jié)果顯示未發(fā)生物種間細胞的交叉污染和惡性轉(zhuǎn)化，遺傳性能穩(wěn)定。 3.在轉(zhuǎn)染后24、48和72h，重組融合蛋白轉(zhuǎn)染率在10.3％-53.2％之間。pEGFP-N3-PURH，pEYFP-N1-PURH與pDsRed1-N1-PURH在北京油雞成纖維細胞的細胞核與細胞質(zhì)均有分布，呈彌散分布。經(jīng)藥物篩選和單克隆化培養(yǎng)，獲得表達pEGFP-N3-PURH，pEYFP-N1-PURH與pDsRed-N1-PURH融合蛋白的陽性