北京油雞部分重要形狀基因克隆及purh基因3種表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、利用RT-PCR方法擴(kuò)增PURH、CD3δ、CD3ε、CD8α、IFNαreceptorl、IFNαreceptor2、IFNy receptor2、RBMX、PEPD、WRB等10個(gè)基因。采用組織塊貼壁培養(yǎng)法，成功地構(gòu)建北京雞成纖維靶細(xì)胞系。提取北京油雞心、肝、脾、肺、腎、腦、腿肌與胸肌等不同組織的總RNA，檢測(cè)PURH基因mRNA的差異表達(dá)水平。將PURH基因完整開(kāi)放閱讀框重組至真核表達(dá)載體pEGFP-N3，pEYFP-N1及pDs

2、Red1-N1，成功構(gòu)建帶有報(bào)告基因的3種真核重組表達(dá)載體。脂質(zhì)體介導(dǎo)導(dǎo)入北京油雞體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞中，對(duì)PURH基因的時(shí)空表達(dá)、亞細(xì)胞定位、陽(yáng)性細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖狀況、細(xì)胞活力以及提高基因表達(dá)率的最佳方法等方面進(jìn)行了深入的研究；并利用G418藥物篩選和對(duì)熒光強(qiáng)度高的單克隆化培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.將10個(gè)基因側(cè)序后提交Genbank。 2.根據(jù)ATCC的細(xì)胞庫(kù)鑒定內(nèi)容與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)所構(gòu)建細(xì)胞系進(jìn)行了生物學(xué)性狀研究、鑒定和

3、綜合評(píng)價(jià)，所得結(jié)果顯示未發(fā)生物種間細(xì)胞的交叉污染和惡性轉(zhuǎn)化，遺傳性能穩(wěn)定。 3.在轉(zhuǎn)染后24、48和72h，重組融合蛋白轉(zhuǎn)染率在10.3％-53.2％之間。pEGFP-N3-PURH，pEYFP-N1-PURH與pDsRed1-N1-PURH在北京油雞成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均有分布，呈彌散分布。經(jīng)藥物篩選和單克隆化培養(yǎng)，獲得表達(dá)pEGFP-N3-PURH，pEYFP-N1-PURH與pDsRed-N1-PURH融合蛋白的陽(yáng)性