基因表達載體構建

1、一、簡述原核生物和真核生物基因表達調控的異同點，并說明基因表達調控與基因工程表達載體構建的關系。1原核生物和真核生物基因表達調控的共同點：（1）結構基因均有調控序列；（2）表達過程都具有復雜性，表現(xiàn)為多環(huán)節(jié)。2不同點：原核生物：（1）RNA聚合酶只有一種，其σ因子決定RNA聚合酶識別特異性；（2）操縱子模型的普遍性；（3）阻遏蛋白與阻遏機制的普遍性（負性調節(jié)占主導）；（4）轉錄和翻譯偶聯(lián)進行；（5）轉錄后修飾、加工過程簡單；（6）轉錄起

2、始是基因表達調控的關鍵環(huán)節(jié)。真核基因表達調控特點：（1）RNA聚合酶有三種，分別負責三種RNA轉錄，每種RNA聚合酶由約10個亞基組成；（2）活性染色質結構發(fā)生變化；（3）正性調節(jié)占主導；（4）轉錄和翻譯分隔進行；（5）轉錄后修飾、加工過程較復雜；（6）轉錄起始是基因表達調控的關鍵環(huán)節(jié)。3.由于基因的表達調控受到多種因子的影響，而構建基因工程表達載體時多是將真和生物的目的基因轉入到原核生物載體上表達，所以應注意以下幾點：（1）外源基因插

3、入序列必須保持正確的方向和閱讀框架。其遺傳密碼不得缺失、遺漏、或錯位及錯碼。否則會導致編碼錯誤的蛋白質分子，特別是目的基因序列內部應不含兩端酶切位點的識別序列。（2）插入的外源基因必須放在原核的啟動子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能夠識別插入的基因。（3）外源基因必須能在大腸桿菌中進行有效轉錄（如無內含子），轉錄后的mRNA在菌體必須相當穩(wěn)定，并且能有效地進行翻譯，轉譯的蛋白分子在菌體內不致于受菌體蛋白酶的降解。二、目的基因功能和

4、表達分析的意義是什么？目的基因功能與表達分析的主要環(huán)節(jié)有哪些？各有什么目的？這些環(huán)節(jié)與基因工程的主要環(huán)節(jié)有什么異同？1意義：克隆的目的基因只有通過表達才能探索和研究基因的功能及基因表達調控的機理，明了其利用價值和途徑。2主要環(huán)節(jié)：（1）目的基因的獲得和加工：將得到的目的基因通過加工以期能連接到表達載體上并穩(wěn)定表達；（2）載體的選擇與加工：根據(jù)不同的實驗目的和實驗條件選擇不同的載體，并誘導型啟動子和組織特異型啟動子三類，它們可使外源基因在

5、植物細胞中表達；當啟動子與顯性選擇標記基因及報告基因連接，構成嵌合基因時，這些標記基因同樣能表達，從而可提供用于篩選和鑒定的表型。（3）植物表達載體的構建中間表達載體不能將外源基因轉化進植物細胞，因此，必須將中間表達載體引入到上述已改造的受體Ti質粒中，并構建成能侵染植物細胞的基因轉化載體(它是由兩種以上質粒構成的復合型載體，故稱之為載體系統(tǒng))，才能在植物基因轉化中應用。為利用根癌農桿菌的Ti質粒，發(fā)展了一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。一元

6、載體系統(tǒng)是指首先將目的基因插入到中間表達載體上，篩選出含有目的基因的重組分子，然后將重組質粒轉化到根癌農桿菌中，重組質粒與Ti質粒上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源基因整合到Ti質粒上，用于侵染植物細胞。TDNA重組分子就可整合到植物細胞染色體DNA上。最后利用植物選擇標記基因篩選轉化細胞。雙元載體系統(tǒng)是指由兩個分別含TDNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質粒構成的系統(tǒng)。其中之一是含有TDNA轉移所必需的Vir區(qū)段質粒，它缺失或部分缺失TDN

7、A序列。它的主要作用是表達毒蛋白，激活TDNA的轉移，故稱為輔助Ti質粒(helperTiplas)；另一個則是含有TDNA的質粒，一般作為目的基因的載體，由于其分子量較小，故稱為微型質粒(miniTiplas)。它是一種寄主范圍廣泛的DNA轉移載體質粒。它既含有大腸桿菌復制起始位點，又含有根癌農桿菌復制起始位點，實際上是一種大腸桿菌農桿菌穿梭質粒。這兩種質粒在單獨存在的情況下，均不能誘導植物產生冠癭瘤。若根癌農桿菌細胞內同時存在這兩種

8、質粒時，便可獲得正常誘導腫瘤的能力。因此，含有雙元載體的根癌農桿菌細胞浸染植物時，就可以將含有目的基因的TDNA整合進植物基因組中。目前以TDNA轉化植物細胞的標準方法大多采用Ti質粒介導的雙元載體系統(tǒng)。首先將目的基因插入到微型質粒，含有目的基因的重組微型質粒轉化大腸桿菌后，再導入攜帶輔助Ti質粒的根癌農桿菌中，經篩選后直接感染植物細胞。根癌農桿菌侵染植物細胞后，植物的創(chuàng)傷信號啟動Ti質粒上的vir基因，隨后將微型質粒上的TDNA切割下