鵝細小病毒VP3基因克隆及真核表達載體的構(gòu)建.pdf

1、本實驗選用鵝細小病毒四平分離珠VP3基因為候選基因，利用堿裂解法提取GPV基因組DNA。應(yīng)用Primer5.0在VP3基因兩側(cè)設(shè)計一對引物P1/P2，利用聚合酶鏈式反應(yīng)從GPV基因組DNA擴增出VP3基因片段。將VP3基因與克隆載體pMDl8-T連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌JM-109中進行克隆。對所提質(zhì)粒進行快速鑒定、PCR鑒定以及限制性內(nèi)切酶NheI和BamHI雙酶切鑒定，篩選陽性重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒測序并進行核苷酸序列分析。結(jié)果表明

2、：GPV四平(SP)株VP3基因長l605nt，包含了完整編碼GPVVP3蛋白閱讀框，且與國內(nèi)GPV分離株B株相應(yīng)核苷酸序列和氨基酸序列的同源性較高，為96.2﹪和97.4﹪，由此說明，GPV四平株VP3基因可以用于構(gòu)建具有普遍應(yīng)用價值的基因工程疫苗的候選基因。 之后，通過一系列酶切連接反應(yīng)將VP3基因成功克隆入真核表達載體pVAXI，構(gòu)建了含有VP3基因的真核表達載體pVAXI-VP3。通過脂質(zhì)體法把pVAXI-VP3轉(zhuǎn)入真核

3、細胞Vero進行表達。轉(zhuǎn)染Vero細胞后，繼續(xù)培養(yǎng)細胞，通過離心方法將細胞離心，提取細胞的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，以P1/P2為引物在mRNA水平檢測外源基因的轉(zhuǎn)錄情況。同時利用熒光抗體技術(shù)，在蛋白質(zhì)水平對外源基因的表達情況進行檢測。結(jié)果表明，RT-PCR結(jié)果可見在1000-2000bp之間可見一DNA條帶；免疫熒光法對表達后蛋白進行檢測，可見特異性熒光。由此說明，本實驗構(gòu)建的pVAXI-VP3真核表達質(zhì)粒能在真