小麥germin基因的克隆及植物表達載體的構(gòu)建.pdf

1、近年來由于基因克隆技術(shù)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的進步,使得通過基因工程方法改善作物的抗病性成為了可能.谷類作物真菌病原菌常導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)而給農(nóng)民帶來巨大的經(jīng)濟損失.一般來說抗真菌轉(zhuǎn)基因的目標(biāo)是加固植物細胞壁和產(chǎn)生抗真菌蛋白以直接或間接抑制真菌生長.有些植物病原菌真菌能分泌大量草酸,而草酸能導(dǎo)致組織腐爛,是致病過程中的關(guān)鍵因子.小麥中的germin是含有Mn離子的同源六聚體,具有草酸氧化酶活性,可將草酸氧化生成H<,2>O<,2>,在發(fā)育和防御過程中

2、起了重要作用.因此將草酸氧化酶基因?qū)胍赘胁〉淖魑镏芯褪轻槍φ婢置诘牟菟岬目共』蚬こ套钚抡J(rèn)識.該研究的目的是獲得小麥germin基因并構(gòu)建植物表達載體,為轉(zhuǎn)germin基因研究提供基礎(chǔ).主要結(jié)果如下:1.小麥germin基因的克隆與序列分析小麥germin具有較強的草酸氧化酶活性.根據(jù)GenBank中的germin gf-2.8同源序列設(shè)計引物,通過PCR擴增,從湘麥13基因組DNA中得到了長度為812bp的目的片段,將PCR產(chǎn)物克

3、隆到pDive載體上并測序.將這一序列在NCBI-BLAST上進行同源性比較,結(jié)果與germin gf-2.8的堿基序列同源性為90％.氨基酸序列的同源性為96％,其中有九個氨基酸不同,但基本上為同等氨基酸,并且符合germin中三組氨酸和一谷氨酸的草酸氧化酶活性位點的同源模型特征.2.Germin基因植物表達載體的構(gòu)建將中間載體上的germin基因片段用BamHⅠ酶切下來,插入用同樣酶切的雙元表達載體pBI121上,以菌落PCR篩選重

4、組子.對這些重組子用HindⅢ酶切以進行正反方向檢測,所有重組子酶切都得到一大片段和一小片段.但反向克隆的重組子得到的小片段大小為1,567bp,正向克隆的重組子所得的小片段大小為968bp,并命名正向克隆的重組子為pBG128.將pBG128用電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404,并進行了菌落PCR驗證.3.GUS基因的瞬時表達轉(zhuǎn)入pBG128根癌農(nóng)桿菌LBA4404培養(yǎng)到OD600值為0.3-0.4,用乙酰丁香酮進行誘導(dǎo)激活,然后與W